Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Summary

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Abstract

Muitas proteínas interagir transientemente com outras proteínas ou são integrados em complexos multi-proteína para desempenhar a sua função biológica. Complementação fluorescência bimolecular (BiFC) é um método in vivo para monitorizar estas interacções em células vegetais. No protocolo apresentou as proteínas candidatas investigados são fundidas com as metades complementares de proteínas fluorescentes e as respectivas construções são introduzidas em células de plantas por meio de transformação mediada por Agrobacterium. Subsequentemente, as proteínas são expressas transitoriamente em folhas de tabaco e os sinais fluorescentes restaurado pode ser detectada com um microscópio confocal de varrimento laser nas células intactas. Isto permite não só a visualização da própria interacção, mas também a localização subcelular dos complexos de proteína pode ser determinada. Para esta finalidade, genes marcadores que contêm um marcador fluorescente pode ser co-expresso juntamente com as construções BIFC, visualizando, assim, estruturas celulares, tais como tele retículo endoplasmático, mitocôndria, o aparelho de Golgi ou na membrana plasmática. O sinal fluorescente pode ser monitorada, quer directamente na epiderme foliar ou em protoplastos individuais, que podem ser facilmente isolados a partir de folhas de tabaco transformadas. BiFC é ideal para estudar as interações proteína-proteína em seu ambiente natural dentro da célula viva. No entanto, isso tem de ser considerado que a expressão tem de ser accionada por promotores fortes e que os parceiros de interacção são modificadas devido à fusão das marcações de fluorescência relativamente grandes, o que pode interferir com o mecanismo de interacção. No entanto, BiFC é uma abordagem complementar excelente para outros métodos vulgarmente utilizados para investigação de interacções proteína-proteína, tais como coimmunoprecipitation, os ensaios in vitro suspensos ou experiências de levedura de dois híbridos.

Introduction

Estudando a formação de complexos de proteínas e a sua localização em células de plantas in vivo é essencial para investigar redes celulares, a sinalização e os processos metabólicos. BiFC permite a visualização de interações proteína-proteína em seu ambiente natural diretamente dentro da célula vegetal vida ^1-5.

No BiFC aproximar a complementação de dois fragmentos N-e C-terminais não fluorescentes de uma ligação de proteína fluorescente para uma proteína fluorescente reconstituído. Fragmentos de muitas proteínas fluorescentes diferentes têm sido utilizados para detectar interacções de proteínas, por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP), o cromóforo de que é quimicamente formado por três resíduos distintas ^6. As proteínas fluorescentes pode ser reduzido para metade dentro de um loop ou ß-fio para resultar nos dois fragmentos não fluorescentes, que podem ser fundidos para ambas as proteínas de interesse. O ensaio pode ser utilizado para detectar interacções, em qualquer compartme subcelularnt em qualquer organismo cresce aerobicamente ou células que podem ser geneticamente modificados para expressar as proteínas de fusão. Se as duas proteínas de entrar em estreita proximidade no interior da célula, a fluorescência é reconstituído e pode ser monitorizada por microscopia, sem a adição de corantes ou fluoróforos exógenos ^3.

Tabaco (Nicotiana benthamiana) provou ser um organismo modelo conveniente para visualizar a interacção de proteínas de plantas, uma vez que as proteínas podem ser facilmente expressas utilizando a transformação mediada por Agrobacterium de folhas de tabaco com as construções gerados. Agrobacterium usar um assim chamado plasmídeo Ti (indução de tumores) que codificam para as enzimas que medeiam a transdução do gene de interesse em células de plantas. BiFC é também aplicável para a solúvel, bem como para as proteínas de membrana dentro de todos os compartimentos celulares e tem sido utilizado com êxito nos últimos anos para identificar proteínas que interagem in vivo, bem como para analisar os sítios de interacçãodentro das proteínas ^7-9. Após a expressão dos genes introduzidos, a interacção das proteínas fluorescentes podem ser visualizados directamente nas folhas, o que é adequado para estruturas celulares maiores, tais como o retículo endoplasmático (ER), a membrana plasmática ou cloroplastos. No entanto, para controlar a localização de estruturas mais refinados, por exemplo, o invólucro do cloroplasto, é aconselhável para visualizar fluorescência em protoplastos isolados a partir de folhas de tabaco transformadas. Um conjunto de vectores BIFC contendo quer um C-terminal ou uma etiqueta fluorescente do terminal-N tem que ser utilizado para a abordagem BiFC em plantas ^10. O protocolo descrito a seguir foi usado para estudar a interação de citosólica proteína de choque térmico 90 (HSP90), com o tetratricopeptide repetição (TPR) de domínio que contém proteínas de encaixe Toc64 e AtTPR7 que residem no envelope exterior cloroplastos e retículo endoplasmático, respectivamente ^11-13. Para esta finalidade, a HSP90 foi fundido com o Ctparte erminal de SCFP (SCFP ^C). A marca foi N-terminal fundido com a chaperona para garantir a acessibilidade do motivo C-terminal de ligação MEEVD de HSP90 a braçadeira do tipo com domínios TPR. Em paralelo, a parte N-terminal de Vênus (Venus ^N) foi fundido com os domínios citosólicos do domínio TPR contendo proteínas de encaixe Toc64 e AtTPR7, respectivamente. Como um controlo negativo, clonado a parte C-terminal solúvel de SCFP ^C unicamente que reside no citossol e é, por conseguinte, um controlo apropriado.

As marcas fluorescentes das proteínas estudadas têm que enfrentar o mesmo compartimento celular para permitir a proximidade e, assim, a reconstituição do sinal fluorescente. Para determinar a localização do sinal de fluorescência de uma proteína marcador reconstituído fundido com uma etiqueta fluorescente diferente podem ser co-transformados para demonstrar a localização subcelular da interacção. Uma proteína marcadora ER fundido com mCherrry foi transformada simultaneamente nocaso do PS localizado AtTPR7 ^14. A autofluorescência de clorofila serviu como marcador de cloroplasto em caso de Toc64. Por isso, não só a interacção in vivo da Toc64 AtTPR7 e, respectivamente, com o acompanhante citosólico HSP90 pode ser monitorizada directamente nas folhas de tabaco, mas também a localização subcelular da interacção pode ser investigada.

BiFC é bem adequado como uma abordagem complementar a outros métodos que estudam as interações proteína-proteína. Comparado com coimmunoprecipitation ou em experiências de pull-down in vitro, por exemplo, não há anticorpos específicos têm de estar disponíveis para as proteínas de interesse, e as proteínas não tem que ser expresso de forma recombinante, in vitro, que pode ser um desafio, em especial para as proteínas de membrana. Além disso, também as interacções transiente pode ser monitorizada utilizando BiFC, uma vez que as proteínas são capturadas pela interacção dos marcadores fluorescentes com fusíveis ^15.

Protocol

1. Transformação de BiFC Constrói em Agrobacteria Clonagem das construções BIFC Amplificar o gene de interesse a partir de um molde adequado, utilizando os oligonucleótidos que contêm locais attB que flanqueiam-. Realize uma PCR utilizando uma polimerase de revisão. Adaptar o comprimento do passo de recozimento para a combinação de iniciadores concebidos e o comprimento do passo de alongamento de acordo com o tamanho do fragmento. Verifique o produto de PCR por electroforese em gel de agaro…

Representative Results

Neste exemplo foi utilizado o método BiFC para monitorar a interação do HSP90 chaperone molecular citosólica com as proteínas de ancoragem de membrana AtTPR7 e Toc64. AtTPR7 faz parte do translocon Sec e interage com acompanhantes citosólicos, que possivelmente entregar pré-proteínas secretoras para translocação pós-translacional para a membrana do RE. Da mesma forma, Toc64 no envelope exterior cloroplasto atua na importação de pós-translacionais, recebendo pré-proteínas HSP90 cloroplastos associados. Am…

Discussion

Ao planejar um experimento BiFC vários pontos devem ser considerados. Embora não haja informação estrutural sobre as proteínas de interesse é necessária, a topologia tem que ser conhecida quando se trabalha com as proteínas da membrana que mede. As proteínas fluorescentes têm de residir no mesmo compartimento subcelular ou enfrentar o mesmo lado de uma membrana para permitir a interacção. Naturalmente, quando a análise de proteínas que requerem uma sequência de direccionamento do terminal N, apenas uma et…

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)