Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Summary

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Abstract

Viele Proteine ​​interagieren transient mit anderen Proteinen oder in Multiproteinkomplexe integriert, um ihre biologische Funktion ausüben. Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ist eine in vivo-Methode, um solche Interaktionen in Pflanzenzellen zu überwachen. Im dargestellten Protokoll untersuchten Kandidatenproteine ​​sind, um komplementäre Hälften der fluoreszierenden Proteinen fusioniert und die jeweiligen Konstrukte sind über Agrobacterium-vermittelte Transformation in die Pflanzenzellen eingeführt. Anschließend werden die Proteine ​​in Tabakblättern transient exprimiert und die restaurierten Fluoreszenzsignale können mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop in den intakten Zellen nachgewiesen werden. Dies ermöglicht nicht nur die Visualisierung der Interaktion selbst, sondern auch die subzelluläre Lokalisation der Proteinkomplexe bestimmt werden. Zu diesem Zweck kann Markergene, die eine fluoreszierende Markierung zusammen mit den Konstrukten BiFC koexprimiert werden, wodurch die Visualisierung Zellstrukturen wie ter endoplasmatischen Retikulum, Mitochondrien, dem Golgi-Apparat oder der Plasmamembran. Das Fluoreszenzsignal kann entweder direkt in Blatt-Epidermiszellen oder in einzelnen Protoplasten, die sich leicht aus den transformierten Tabakblättern isoliert werden, können überwacht werden. BIFC ist ideal geeignet, um Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung in der lebenden Zelle zu untersuchen. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Ausdruck von starken Promotoren gesteuert werden, und dass die Interaktionspartner werden durch Fusion der relativ großen Fluoreszenz-Tags, die mit der Wechselwirkungsmechanismus stören könnte modifiziert werden. Dennoch ist eine ausgezeichnete BIFC ergänzenden Ansatz zu anderen häufig angewendeten Methoden der Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, wie Coimmunpräzipitation, in vitro Pulldown-Assays oder Hefe-Zwei-Hybrid-Experimenten.

Introduction

Studieren die Bildung von Proteinkomplexen und ihre Lokalisation in Pflanzenzellen in vivo ist wichtig, Mobilfunknetze zu untersuchen, Signal-und Stoffwechselprozesse. BIFC ermöglicht die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung direkt in der lebenden Pflanzenzelle ^5.1.

Im BiFC Ansatz der Komplementierung von zwei nicht-fluoreszierenden N-und C-terminale Fragmente eines fluoreszierenden Proteins führen zu einem fluoreszierenden Protein rekonstituiert. Fragmente von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen verwendet worden, um Protein-Wechselwirkungen zu detektieren, z. B. das grün fluoreszierende Protein (GFP), von denen das Chromophor chemisch durch drei unterschiedliche Reste ⁶ gebildet. Fluoreszierende Proteine ​​können in einer Schleife oder ß-Strang in den beiden nicht-fluoreszierenden Fragmente, die beiden Proteine ​​von Interesse fusioniert werden kann führen zu halbieren. Der Test kann verwendet werden, um Wechselwirkungen in jedem Fach vier subzellulärer erkennennt in jedem aerob wachsenden Organismus oder Zellen, die genetisch modifiziert werden können, um die Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Wenn die beiden Proteine ​​in enge Nähe innerhalb der Zelle zu kommen, wird die Fluoreszenz wieder hergestellt und kann durch Mikroskopie ohne Zugabe von exogenen Fluorophoren oder Farbstoffe ³ überwacht werden.

Tabak (Nicotiana benthamiana) hat sich als praktisch Modellorganismus, um die Wechselwirkung von Pflanzenproteinen zu visualisieren, da Proteine ​​kann leicht durch die Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Transformation von Tabakblättern mit den generierten Konstrukte exprimiert werden. Agrobakterien mit einem sogenannten Ti-Plasmid (Tumor-induzierend) für Enzyme, die die Transduktion des Gens in Pflanzenzellen vermitteln Codierung. BiFC ist auch anwendbar für lösliche als auch für Membranproteine ​​in allen zellulären Kompartimenten und wurde erfolgreich in den letzten Jahren verwendet, um interagierende Proteine ​​identifizieren, die in vivo als auch Interaktionsstellen zu analysiereninnerhalb der Proteine ^​​7-9. Nach der Expression der eingeführten Gene, kann die Wechselwirkung der fluoreszierenden Proteine ​​direkt in den Blättern sichtbar gemacht werden, was für größere Zellstrukturen, wie dem endoplasmatischen Retikulum (ER), die Plasmamembran oder Chloroplasten. Um aber die Lokalisation in feiner Strukturen zu überwachen, zum Beispiel die Chloroplasten-Umschlag, ist es ratsam, die Fluoreszenz-in-Protoplasten aus transformierten Tabakblättern getrennt visualisieren. Eine Reihe von Vektoren, die BiFC entweder eine C-terminale oder N-terminale fluoreszierende Markierung hat, um die Pflanzen in BiFC Ansatz ¹⁰ verwendet werden. Die im Folgenden beschriebenen Protokoll wurde verwendet, um die Interaktion von cytosolischen Hitzeschockprotein 90 (HSP90) mit der Tetratricopeptid repeat (TPR)-Domäne Docking Proteine ​​Toc64 und AtTPR7 Wohnsitz in der Chloroplasten-Außenhülle und dem endoplasmatischen Retikulum, jeweils ^{von 11 bis 13} enthält, zu studieren. Zu diesem Zweck wurde auf die HSP90 Ct verschmolzenerminal Teil SCFP (SCFP ^C). Das Tag war N-terminal an das Chaperon fusioniert, um die Zugänglichkeit von der C-terminalen MEEVD Bindungsmotiv von HSP90 TPR-Domänen-Klemme zu gewährleisten. Parallel dazu ist der N-terminale Teil von Venus (Venus ^N) an die zytosolische Domäne des TPR-Domäne Andocken Proteine ​​Toc64 und AtTPR7 jeweils enthaltend fusioniert wurde. Als Negativkontrolle klonierten wir das lösliche C-terminalen Teil des ^C SCFP ausschließlich die im Cytosol befindet, und ist daher eine geeignete Steuerung.

Die fluoreszierenden Markierungen der untersuchten Proteine ​​haben den gleichen Zellabteil zugewandt Nähe und dadurch Auflösen des Fluoreszenzsignals zu ermöglichen. Um die Lokalisierung des rekonstituierten Fluoreszenzsignal ein Markerprotein an eine andere fluoreszierende Markierung fusioniert ist cotransformiert die subzelluläre Lokalisation der Wechselwirkung nachzuweisen bestimmen. Ein ER-Markerproteins fusioniert mCherrry wurde gleichzeitig in den transformiertenBei der ER AtTPR7 ¹⁴ angeordnet. Die Autofluoreszenz des Chlorophylls diente als Chloroplasten-Marker bei Toc64. Dadurch nicht nur die in vivo Interaktion von Toc64 AtTPR7 und jeweils mit der cytosolischen Chaperone HSP90 in den Tabakblättern direkt überwacht werden, sondern auch die subzelluläre Lokalisation der Wechselwirkung untersucht werden.

BIFC ist als Ergänzung zu den anderen Methoden Studium von Protein-Protein-Interaktionen geeignet. Im Vergleich zu Coimmunpräzipitation oder in vitro Pull-down-Experimente, zum Beispiel, haben keine spezifischen Antikörper gegen die Proteine ​​von Interesse vorhanden sein, und die Proteine ​​müssen nicht rekombinant in vitro exprimiert werden, was schwierig sein kann, insbesondere für Membranproteine. Außerdem können auch transiente Interaktionen mit BiFC überwacht werden, da die Proteine ​​durch die Wechselwirkung der kondensierten Fluoreszenzmarkierungen ¹⁵ eingefangen.

Protocol

1. Transformation von Agrobakterien in BIFC Konstruiert Klonierung der Konstrukte BIFC Amplify das Gen von Interesse aus einer entsprechenden Vorlage mit Oligonukleotiden, die flankierenden attB-Websites. Führen Sie eine PCR unter Verwendung eines Korrekturlesen-Polymerase. Anpassung der Länge der Wärmebehandlungsschritt, um die Primer-Kombination ausgebildet und die Länge des Verlängerungsschritt gemäß der Fragmentgröße. Überprüfen Sie die PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese und …

Representative Results

In diesem Beispiel verwendeten wir die BiFC Methode, um die Interaktion des zytosolischen Chaperon Hsp90 mit den Membranproteinen Docking AtTPR7 und Toc64 überwachen. AtTPR7 ist Teil der Sec Translokons und interagiert mit zytosolischen Chaperone, die möglicherweise liefern sekretorischen Präproteinen für post-translationalen Translokation an der ER-Membran. Ebenso Toc64 an der Außenhülle wirkt Chloroplasten in post-translationalen Import durch den Empfang HSP90 assoziiert Chloroplasten Präproteinen. Beide Protei…

Discussion

Bei der Planung einer BIFC Experiment mehrere Punkte berücksichtigt werden. Obwohl keine strukturelle Informationen über die Proteine ​​von Interesse erforderlich ist, hat der Topologie bekannt sein, wenn mit der Membran überspannenden Proteinen. Die fluoreszierenden Proteine ​​in der gleichen subzellulären Kompartiment befinden oder in die gleiche Seite einer Membran, um die Interaktion zu ermöglichen. Natürlich, wenn die Analyse-Proteine, die eine N-terminale Targeting-Sequenz erforderlich ist, kann nur …

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)