Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья
Summary
Формирование белковых комплексов в естественных условиях могут быть визуализированы бимолекулярного флуоресценции дополнения. Взаимодействие партнеров сливают с дополнительными частями флуоресцентных меток и временно экспрессированного в листьях табака, в результате чего восстановленного флуоресцентного сигнала при непосредственной близости от двух белков.
Abstract
Многие белки взаимодействуют временно с другими белками или интегрированы в мульти-белковых комплексов выполнять свою биологическую функцию. Бимолекулярного флуоресценции комплементация (BiFC) является методом в естественных условиях для мониторинга таких взаимодействий в клетках растений. В представленном протокола исследованные белки-кандидаты слиты с дополнительными половин флуоресцирующих белков и соответствующие конструкции вводятся в клетки растений через агробактериальной трансформации. Впоследствии белки временно экспрессируется в листьях табака и восстановленные флуоресцентные сигналы могут быть обнаружены с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в неповрежденных клетках. Это позволяет не только визуализацию самого взаимодействия, но и внутриклеточной локализации белковых комплексов может быть определена. Для этой цели маркерные гены, содержащие флуоресцентной метки можно коэкспрессируются вместе с конструкциями BiFC, таким образом визуализации клеточных структур, таких как Тон эндоплазматической сети, митохондрий, аппарата Гольджи или плазматическую мембрану. Флуоресцентный сигнал можно контролировать либо непосредственно в эпидермальных клетках листьев или в отдельных протопластов, которые могут быть легко выделенных из трансформированных листьев табака. BiFC идеально подходит для изучения белок-белковых взаимодействий в их естественной среде в живой клетке. Тем не менее, он должен считать, что выражение должно быть обусловлен сильных промоторов и что партнеры взаимодействия изменяются в результате синтеза относительно больших меток флуоресценции, которые могут помешать механизма взаимодействия. Тем не менее, BiFC является отличным дополнительный подход к другим обычно применяемых методов следственных белок-белковых взаимодействий, таких как коиммунопреципитации подтверждено, в пробирке выпадающие анализов или дрожжей двугибридная эксперименты.
Introduction
Изучение образование белковых комплексов и их локализация в клетках растений в естественных условиях имеет важное значение для расследования сотовых сетей, сигнализации и метаболические процессы. BiFC позволяет визуализировать белок-белковых взаимодействий в их естественной среде непосредственно внутри живой клетки растения 1-5.
В BiFC подойти к комплементации двух нефлуоресцирующих N-и С-концевых фрагментов флуоресцентного белка приводит к восстановленной флуоресцентного белка. Фрагменты многих различных флуоресцентных белков были использованы для обнаружения белковых взаимодействий, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) хромофор, который химически образована тремя различными остатками 6. Флуоресцентные белки можно сократить вдвое в течение цикла или бета-цепи, чтобы привести в двух нефлуоресцирующих фрагментов, которые могут быть слиты с обоих белков, представляющих интерес. Анализ может быть использован для обнаружения взаимодействий в любом субклеточном compartmeнт в любом аэробно растущего организма или клетки, которые могут быть генетически модифицированной для экспрессии слитых белков. Если эти два белка вступают в непосредственной близости внутри клетки, флуоресценция восстанавливают и могут быть проверены с помощью микроскопии без добавления экзогенных флуорофоров или красители 3.
Табак (Nicotiana benthamiana) оказалась удобной моделью организм визуализировать взаимодействие растительных белков, так как белки могут быть легко выражены с использованием агробактериальной преобразование табачные листья с сгенерированных конструкций. Agrobacteria использовать так называемый Ti плазмиду (опухоли) индуцировать кодирующих ферменты, которые опосредуют трансдукцию интересующего гена в клетках растений. BiFC хорошо применимы для растворимого, а также для мембранных белков внутри всех сотовых отсеков и успешно используется на протяжении последних лет для выявления взаимодействующих белков в естественных условиях, а также для анализа места взаимодействияв белках 7-9. При экспрессии введенных генов, взаимодействие флуоресцирующих белков могут быть визуализированы непосредственно в листьях, который подходит для более крупных клеточных структур, таких как эндоплазматический ретикулум (ER), плазматической мембране или хлоропластов. Тем не менее, для контроля локализации в более совершенных конструкций, например, хлоропласт конверт, желательно, чтобы визуализировать флуоресценцию в протопласты, выделенных из трансформированных листьев табака. Набор BiFC векторов, содержащих либо С-концевой или N-концевой флуоресцентной метки должен быть использован для подхода BiFC в растениях 10. Описанный протокол далее был использован для изучения взаимодействия цитозольным белка теплового шока 90 (HSP90) с tetratricopeptide повторения домена (TPR), содержащий Док белки Toc64 и AtTPR7 проживающих в хлоропластов внешней оболочки и эндоплазматической сети, соответственно 11-13. Для этой цели HSP90 был слит с Cterminal часть SCFP (SCFP C). Тег был N-терминальной слит с компаньонкой, чтобы обеспечить доступность С-концевой MEEVD обязательного мотивом HSP90 чтобы пресечь типа TPR доменов. Параллельно с этим, N-концевая часть Венеры (Venus N) был присоединен к цитозольными доменов домена TPR, содержащей Док белки Toc64 и AtTPR7 соответственно. В качестве отрицательного контроля мы клонировали растворимого С-концевой частью SCFP С исключительно которая находится в цитозоле и, следовательно, соответствующий контроль.
Флуоресцентные метки изучаемых белков должны столкнуться с той же сотовой отсек, чтобы позволить непосредственной близости и тем самым воссоздание флуоресцентного сигнала. Чтобы определить локализацию восстановленного флуоресцентного сигнала маркер белок, слитый с другом флуоресцентной метки можно котрансформировали, чтобы продемонстрировать внутриклеточную локализацию взаимодействия. ER белковый маркер слит с mCherrry была преобразована одновременно вСлучай ЭР расположенного AtTPR7 14. Аутофлюоресценция хлорофилла служил хлоропластов маркера в случае Toc64. Под этим не только взаимодействие в естественных условиях Toc64 и AtTPR7, соответственно, с цитозольной HSP90 шаперона можно контролировать непосредственно в листьях табака, но и внутриклеточной локализации взаимодействия могут быть исследованы.
BiFC хорошо подходит в качестве дополнительного подхода к другим методам, обучающихся белок-белковых взаимодействий. По сравнению с коиммунопреципитации подтверждено или в пробирке эксперименты ниспадающих, например, нет специфических антител не должны быть доступны для представляющих интерес белков, а белки не должны быть рекомбинантно экспрессировали в пробирке, который может быть сложным, особенно для мембранных белков. Кроме того, также переходные взаимодействия можно контролировать с помощью BiFC, так как белки захвачен взаимодействия конденсированных флуоресцентных меток 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
По планируете эксперимент BiFC несколько точек должны быть рассмотрены. Хотя никакого структурного информация о представляющих интерес белков не требуется, топология должен быть известен при работе с мембраной белков. Флуоресцентные белки должны находиться в том же субклеточной отдел…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Юргена Soll за полезные обсуждения и Крис Кэрри за критическое прочтение рукописи. Этот проект финансировался DFG и Fonds дер Chemischen Industrie (гранты цифры SFB 1035, проекта A04 к СС и ли 187/22 для РС).
Materials
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
References
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
- Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
- McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
- Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
- Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
- Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
- Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
- Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).
