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Chemistry

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

Uma abordagem modular para a síntese de N- os glicanos para fixação a um vidro revestido de óxido de alumínio slide (slide ACG) como desenvolveu um microarray glicano e demonstrou-se seu uso para a criação de perfil de um HIV amplamente neutralizando anticorpos.

Abstract

Apresentamos uma maneira altamente eficiente para a preparação rápida de uma vasta gama de N-ligadas a oligossacarídeos (estima-se que para exceder 20.000 estruturas) que são comumente encontrados em glicoproteínas humanas. Para alcançar a desejada diversidade estrutural, a estratégia começou com a síntese enzimática de quimioterapia de três tipos de módulos de fluoreto de oligosaccharyl, seguidos por sua gradual glycosylations α-seletiva para o 3-Ó e 6-O posiciona do resíduo de manose do trissacarídeo núcleo comum, tendo uma ligação crucial β-mannoside. Ainda mais, nós unimos os N- glicanos à superfície de uma lâmina de vidro revestido de óxido de alumínio (ACG) para criar uma matriz covalente mista para a análise da interação de hetero-ligante com um anticorpo de HIV. Em particular, o comportamento de vinculação de um recém isolados VIH-1 amplamente neutralizante anticorpo (bNAb), PG9, a mistura de espaçadas homem5GlcNAc2 (homem5) e 2,6-di-sialylated bi-antennary complexo tipo N- glicano (SCT ) em uma matriz ACG, abre uma nova avenida para guiar o projeto immunogen eficaz para o desenvolvimento de vacina contra HIV. Além disso, nossa matriz ACG encarna uma poderosa ferramenta para estudar outros anticorpos de HIV para o comportamento de vinculação de hetero-ligante.

Introduction

Os N- glicanos em glicoproteínas estão covalentemente ligados à asparagina (Asn) resíduo de sequon de Asn-Xxx-Ser/Thr o consenso, que afetam vários processos biológicos, tais como reconhecimento de conformação, antigenicidade, solubilidade e lectina de proteína 1 , 2. a síntese química de N-oligossacarídeos vinculados representa um desafio sintético significativo devido à sua enorme heterogeneidade micro estrutural e arquitetura altamente ramificada. A seleção cuidadosa de proteger grupos de sintonizar a reatividade dos blocos de construção, alcançar a seletividade em centros anomérico e uso correto de promotor / activator(s) são elementos-chave na síntese de oligossacarídeos complexos. Para resolver este problema da complexidade, uma grande quantidade de trabalho para avançar N- glicano síntese foi relatada recentemente3,4. Apesar dessas abordagens robustas, encontrar um método eficaz para a preparação de uma vasta gama de N- os glicanos (~ 20.000) permanece um grande desafio.

A taxa de mutação rápida do HIV-1 para atingir a extensa diversidade genética e sua capacidade de escapar de neutralizar a resposta imunitária, está entre os maiores desafios para desenvolver uma vacina segura e profilática contra HIV-15,6 , 7. uma tática eficaz que o HIV usa para evitar a resposta imune do hospedeiro é a glicosilação pós-traducional de gp120 de glicoproteína do envelope com um diverso N-ligados os glicanos derivados do anfitrião glycosylation máquinas8, 9. Um relatório recente sobre a análise precisa de recombinação monomérico HIV-1 gp120 glicosilação de células de rim humano embrionário (HEK) 293T sugere a ocorrência de microheterogeneity estrutural com um padrão característico de célula específico10 , 11 , 12. portanto, a compreensão das especificidades de glicano do HIV-1 bNAbs requer gp120 bem caracterizadas relacionados N- glicano estruturas em quantidade suficiente para análise.

A descoberta da tecnologia microarray de glicano fornecido alta exploração baseada na taxa de transferência de especificidades de uma diversa gama de proteínas carboidratos, adesinas vírus/bactérias, toxinas, anticorpos e lectines13,14 . O arranjo os glicanos sistemática em um formato de matriz baseada no chip poderia determinar interações do proteína-glicano problemático baixa afinidade a apresentação multivalentes15,16,17,18. Este arranjo de chip baseada glicano convenientemente aparece efetivamente imitar interfaces de celular. Para enriquecer a tecnologia e a superar a questão desigual associada com formatos de matriz convencional, nosso grupo desenvolveu recentemente um glicano matriz sobre uma lâmina de vidro revestido de óxido de alumínio (ACG) usando os glicanos de terminou de ácido fosfônico para aumentar a intensidade do sinal, homogeneidade e sensibilidade19,20.

Para melhorar o entendimento atual sobre glicano epitopos de HIV-1 recém isoladas amplamente neutralizando anticorpos (bNAbs), temos desenvolvido uma estratégia modular altamente eficiente para a preparação de um vasto leque de N-ligados os glicanos21 ,22 para serem impressos em um ACG deslize (ver Figura 1). Especificidade de estudos de perfil de bNAbs de HIV-1 em uma matriz ACG ofereceram a detecção incomum de comportamento de vinculação de hetero-glicano de bNAb altamente potente PG9 que foi isolado do HIV infectados indivíduos23,24,25.

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Protocol

1. preparação de D1/D2 braço módulos22

  1. Preparação de intermediário 2
    1. Pesar a partir de material 1 (mostrado na Figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) em um tubo de 15 mL e dissolver em Tris tampão (25 mM, pH 7,5) contendo dicloreto de manganês (MnCl2, 10mm) para obter uma concentração final de glicano de 5 mM.
    2. Adicione 2 equivalentes de galactose de difosfato de uridina (UDP-Gal).
    3. Adicionar 150 unidades de enzima β-1, 4 galactosyl transferases do leite bovino e incubar a mistura a 37 oC por 15 h.
    4. Depois de 15 h, realizar a cromatografia de camada fina (TLC) para indicar o consumo total de material começar manchando a mistura de reação em uma placa de TLC, desenvolvendo com n-butanol/ácido acético ácido/água (H2O) em 1:1:1 relação e coloração por um solução de molibdato de amónio de cério 0,25 M seguido de aquecimento. Em seguida, saciar a reação por aquecimento a 90 oC por 5 min.
    5. Centrifugue a mistura de reação a uma velocidade de 2.737 x g, durante 3 min e carregar o sobrenadante na parte superior da coluna de gel de poliacrilamida (ver Tabela de materiais). Eluir a coluna usando água destilada deionizada e recolher o produto com frações de 1 a 2 mL.
    6. Monitorar as fracções recolhidas por TLC26, desenvolvendo com n-butanol: H2o: ácido acético em um 1:1:1 ratio e a mancha com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento. Lyophilize27 o produto contendo frações para obter 2 intermediário (115 mg, 86%) como pó branco. Caracteriza o produto por NMR28 e espectroscopia de massa29 (consulte o arquivo de dados suplementares).
  2. Preparação de 3 intermediário
    1. Pesar a partir de material 2 (mostrado na Figura 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80mg, 0.122 mmol)) em um tubo de 15 mL e dissolvê-lo em Tris tampão (25 mM, pH 7,5) contendo MnCl2 (10 mM) para preparar uma concentração final de glicano de 5 mM.
    2. Adicione 2 equivalentes de sal dissódico de 5'-diphospho-β-L-fucose de guanosina (PIB-Fuc).
    3. Adicionar 150 unidades da enzima α-1, 3 sub-celular transferases de Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695) e incubar a mistura a 37 oC por 15 h.
    4. Siga o passo 1.1.4.
    5. Siga o passo 1.1.5.
    6. Siga o passo 1.1.6 para obter intermediário 3 (82 mg, 84%) como pó branco. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).
  3. Preparação dos módulos 4 e 5
    1. Pesar o composto 2,-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside de de p(g 0,230, 0,360 mmol) ou composto 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0.125 mmol) em um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL e seco sob vácuo durante 30 min.
    2. Retirar o frasco do vácuo, preenchê-lo com gás nitrogênio, adicionar uma barra de agitação magnética, tampá-lo com um septo de borracha e anexar um balão de nitrogênio.
    3. Injete 7 mL de piridina seca e 3 mL de anidrido acético (Ac2O) o balão colocado em um banho de gelo a 0 oC. Stir a reação resultante para 12 h à temperatura ambiente utilizando um agitador magnético a 600-700 rpm. Evaporar os solventes usando uma giratória evaporador a uma pressão de vácuo de 0 - 10 mbar em 50 oC.
    4. Dilua a mistura crua com 30 mL de diclorometano (DCM) e extrair com hidrogenocarbonato de sódio aquosa saturada (NaHCO3) (2 x 20 mL) em um funil de separação de 50ml.
    5. Extrair novamente a fase aquosa com DCM (3 x 15 mL) e secar as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio. Remover o sulfato de sódio por filtração e lave com DCM (5 mL). Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 400 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    6. Carrega a solução da mistura crua em 2 mL de DCM em cima da cama de sílica.
    7. Eluir a coluna com uma mistura contendo tolueno e acetona de 0 - 20% acetona em tolueno e coletar frações de 5-10 mL.
    8. Monitorar as fracções recolhidas por TLC (etapas 1.1.4 e 1.1.6), desenvolvendo com tolueno/acetona (7/3), e a mancha com uma solução de molibdato de amónio de cério seguido de aquecimento em uma chapa quente.
    9. Evapore o produto contendo frações usando um evaporador rotativo para obter produtos desejados como espuma branca em 72% e rendimento de 85%, respectivamente.
    10. Dissolver os produtos em 7 mL de acetonitrila: Tolueno: H2O em um 4: proporção de 2:1 em um balão de fundo redondo de 25 mL.
    11. Adicione nitrato de amônio cério (2 equivalentes) arrefecendo a 0 oC utilizando um banho de gelo. Misture a reação à temperatura ambiente por 3 h a ~ 500-800 rpm.
    12. Depois TLC indica o consumo total de material começar (TLC desenvolvendo com tolueno/acetona (7/3) e visualizando por absorbância UV para 254 nm ou pela coloração com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento), diluir a mistura reacional com acetato de etila (30 mL) e o extrato com H2O (15 x 2 mL).
    13. Extrair as camadas orgânicas combinadas com 5 mL de solução saturada de cloreto de sódio (NaCl).
    14. Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 240 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    15. Carrega a solução do produto bruto em 2 mL de DCM em cima da cama de sílica. Eluir a coluna com uma mistura contendo tolueno e acetona (0 - 20% de acetona em tolueno) e coletar frações de 5-10 mL. Monitorar as fracções recolhidas por TLC, desenvolvendo com tolueno/acetona (7/3).
    16. Evapore as produto contendo frações usando um evaporador rotativo em 77 vácuo mbar e 40 oC para obter produtos desejados como espumas brancas.
    17. Dissolver os respectivos álcoois em 10 mL de DCM em um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL e frio de-30 oC.
    18. Adicione o trifluoreto de diethylaminosulfur (DAST, 2 equivalentes). Agite a mistura de reação no-30 oC por 2 h.
    19. Depois TLC indica o consumo de material começar (TLC desenvolvendo com tolueno/acetona (4/1) e visualizando por absorbância UV para 254 nm ou pela coloração com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento), diluir a mistura reacional com DCM (30 mL) , e saturada de lavagem com NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Extrair a camada orgânica combinada com 5 mL de solução saturada de NaCl, secá-lo com a adição de sulfato de magnésio anidro, filtrar a mistura após uma lavagem com DCM (5 mL) e recolhê-la para um balão de fundo redondo de single-pescoço de 100 mL.
    21. Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 400 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    22. Carrega a solução do produto bruto em 2 mL de DCM em cima da cama de sílica. Eluir a coluna com uma mistura de tolueno e acetona (0-20% de acetona em tolueno) e coletamos frações de 5-10 mL.
    23. Monitorar as fracções recolhidas por TLC, desenvolvendo com tolueno/acetona (7/3).
    24. Evaporar o produto contendo frações usando um evaporador rotativo para obter produtos desejados 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2--deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl flúor (54% ao longo de 2 etapas) e 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L--fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- Fluoreto de 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl (67% a mais de 2 passos) como sólidos brancos.
    25. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).

2. preparação de glicano 10

  1. Preparação do intermidiate 7
    1. Pesar a prata trifluormetanosulfonato (AgOTf) (0,039 g, 0.155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dicloreto (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0.108 mmol) para um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL, secá-lo sob vácuo de schlenk linha por 30 min, removê-lo do a vácuo e preenchê-lo com gás nitrogênio.
    2. Transferir as recém secas 4 Å peneiras moleculares (0,2 g) para o frasco contendo o AgOTf e Cp2HfCl2, adicionar uma barra de agitação magnética, tampa com o septo imediatamente e adicionar um balão de nitrogênio.
    3. Transferi 3 mL de tolueno seco para o balão com uma seringa de vidro seco. Agitar a mistura de reação por 1h à temperatura ambiente e em seguida, refresque a 0 oC.
    4. Injetar uma solução de doador 4 (Figura 2, g 0,043, 0.046 mmol) e aceitador 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Figura 3, 0,045 g, 0,031 mmol) em 3 mL de tolueno a aferido através do septo, utilizando uma seringa de 10 mL em 0 o C. Agite a mistura de reação em temperatura ambiente por 3 h.
    5. Depois TLC indica o consumo de matérias-primas (TLC, desenvolvendo com DCM/acetona (8,5/1.5) e visualizando por absorbância UV para 254 nm ou pela coloração com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento), saciar a reação por injectar 10 equivalentes de trietila amina.
    6. Filtrar as peneiras moleculares através de uma cama de celite para um balão de fundo redondo de 50 mL e ainda mais lavar com 10 mL de acetato de etilo. Extrair as camadas orgânicas combinadas com uma solução saturada de aquosa NaHCO3 (2 x 20 mL) em um funil de separação de 50ml. Extraia a fase aquosa com acetato de etila (3 x 15 mL).
    7. Extrair as camadas orgânicas combinadas com solução saturada de NaCl (5 mL), seque-o com o uso de sulfato de magnésio anidro, filtre a mistura para remover o sulfato de magnésio, lavar com acetato de etila (3 x 15 mL) e recolher o filtrado em um balão de fundo redondo de 100 mL.
    8. Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 240 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    9. Carrega a solução do produto bruto em DCM em cima da coluna de cama de sílica. Eluir a coluna com uma mistura contendo DCM e acetona (0-10% de acetona em DCM) e coletar frações de 5-10 mL.
    10. Monitore as fracções recolhidas por TLC, desenvolvendo com DCM/acetona (8,5/1.5). Evaporar as frações contendo o produto usando um evaporador rotativo para obter intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[ 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2, 2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopiranósido (0,052 g, 70%), como a espuma branca.
    11. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).
  2. Preparação do intermidiate 8
    1. Um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL, pesar hexasaccharide 7 (Figura 3, 0,040 g, 0,016 mmol), secá-lo sob vácuo por 1h, removê-lo do vácuo, preenchê-lo com gás nitrogênio, adicionar uma barra de agitação magnética e tampá-lo com um septo de borracha.
    2. Transferi 3 mL de acetonitrile:methanol (MeOH) (proporção de 2:1) para o balão.
    3. Adicionar p-tolueno sulfônico mono-hidratado (0,001 g, 0,008 mmol) no balão de reacção e agitar a reação a 800 rpm por 5h.
    4. Depois TLC indica o consumo de material começar (TLC, desenvolvendo com DCM/acetona (8,5/1.5) e visualizando por absorbância UV para 254 nm ou pela coloração com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento), saciar a reação por injectar 10 equivalentes de trietila amina.
    5. Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 337 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    6. Dissolver a mistura crua com cerca de 2 mL de DCM e carregá-lo em cima da cama de sílica.
    7. Eluir a coluna com uma mistura de DCM e acetona (0 - 10% de acetona em DCM) e coletamos frações de 5-10 mL. Monitore as fracções recolhidas por TLC, desenvolvendo com DCM/acetona (8,5/1.5). Evaporar o solvente com o evaporador rotativo 400 mbar aspirador e 40 oC.
    8. Secar o resíduo sob pressão reduzida para dar intermediário 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetil-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figura 3, 0,022 g, 57%) como um sólido branco. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).
  3. Preparação do intermidiate 9
    1. Preparação do intermidiate 9 (Figura 3) foi realizada utilizando o doador 5 (0,015 g, 13.2 µmol) e aceitador 8 (Figura 3, 0,020 g, 8,80 µmol).
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 µmol) e Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 µmol) foram usados como promotores de uma.
    3. Execute as etapas 2.1.1 a 2.1.10 para obter o intermediário 9, 5-Azidopentyl - O-{[2.3.4.6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as espuma branca.
  4. Global desproteção do intermidiate
    1. Pesar o composto 9 (0,010 g, 2,9 µmol) para um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL, adicionar uma barra de agitação magnética, tampa com um septo de borracha e anexar um balão de nitrogênio.
    2. Transferência de 2 mL de 1, 4 dioxano: H2O (4:1) para o balão. Adicione o hidróxido de lítio (LiOH) (0,005 g, 50% por peso) para o balão. Agitar a mistura de reação em 90-100 oC por 12h e deixe-a esfriar no RT
    3. Evaporar os solventes usando um evaporador rotativo e secar o balão sob vácuo por 1h, preenchê-lo com nitrogênio, remova-o do tubo de vácuo e tampá-lo com um septo de borracha.
    4. Injetar o balão através do septo, usando uma seringa de 10 mL em 0 oC. agitar a mistura de reação para 12h em RT 4 mL de piridina seca e 2 mL de anidrido acético
    5. Evaporar os solventes usando um evaporador rotativo, a pressão de vácuo 0-10 mbar em 50 oC.
    6. Dissolver a mistura crua com 30 mL de DCM e extrair a solução saturada aquosa NaHCO3 (2 x 20 mL) em um funil de separação de 50ml.
    7. Extrair novamente a fase aquosa com DCM (3 x 15 mL). Evapore o solvente usando um evaporador rotativo.
    8. Carrega uma solução do produto em cerca de 2 mL de DCM em cima da cama de sílica C18. Eluir a coluna com uma mistura de água e metanol (0 - 100% de metanol em água) e coletar frações de 5-10 mL.
    9. Recolher as frações de produto e evaporar sob pressão reduzida para obter o produto desejado como espuma branca.
    10. Dissolver o produto em 5 mL de metanol seco em um 25 mL redonda balão de fundo e tampá-lo com um septo de borracha.
    11. Transferir 0,1 mL de metóxido de sódio (Almeida) em metanol e cool para 0 oC utilizando um banho de gelo e agitar a mistura por 12 h.
    12. Remover o solvente usando um evaporador rotativo e secagem do produto sob alto vácuo.
    13. Dissolver os produtos brutos em 5 mL de metanol: H2o: acético (6:3:1).
    14. Adicionar hidróxido de paládio (Pd(OH)2) (50% em peso) e agitar a reação sob atmosfera de hidrogênio usando um balão de hidrogênio para 15 h.
    15. A reação através de uma cama de celite do filtro e lave com 2 mL de metanol seguido de 2 mL de água de dd.
    16. Evapore os solventes usando um evaporador rotativo.
    17. Dissolver a mistura crua com aproximadamente 1 mL de água e carregá-lo em cima da cama de gel de poliacrilamida (ver Tabela de materiais). Eluir o produto com água e coletar frações de 1 a 2 mL.
    18. Monitorar as fracções recolhidas por TLC, desenvolver com n-butanol: H2o: acético (1:1:1).
    19. Recolher as frações de produto e lyophilize para obter o produto desejado 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a pó branco.
    20. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).

3. preparação dos glicanos com cauda ácido fosfônico19,22

  1. Pesar o respectivo glicano (2-5 µmol) num balão de fundo redondo de 5 mL, adicionar uma barra de agitação magnética e tampá-lo com um septo de borracha.
  2. Transferência de 400 µ l de dimetilformamida recém seca.
  3. Adicionar [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) fosforilo) etoxietoxi) carbonato de etila (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl)] (10-25 µmol, preparado em casa) para a solução de glicano. Agite a mistura a 800 rpm por 5h.
  4. Evaporar os solventes usando um evaporador rotativo a 5-10 mbar vácuo pressão em 40 oC.
  5. Dissolver a mistura reacional em 0,5 mL de água e de carga na parte superior da cama gel de poliacrilamida (ver Tabela de materiais). Eluir o produto usando água e coletar frações de 1 a 2 mL.
  6. Monitore as fracções recolhidas por TLC26. Manchar a mistura de reação em uma placa de TLC e adicionar solução de mancha de molibdato de amónio de cério 0,25 M; Siga por aquecimento usando uma chapa quente. Recolher o produto contendo frações e lyophilize para obter o produto desejado como um pó branco.
  7. Dissolver o produto em 2 mL de água e adicionar o Pd (OH)2 (50% em peso). Misture a reação a 800 rpm sob atmosfera de hidrogênio usando um balão de hidrogênio para 15 h.
  8. A reação através de uma cama de fluxo-calcinado do filtro e lave com 2 mL de metanol seguido de 2 mL de água destilada deionizada. Evaporar os solventes usando um evaporador rotativo a 300 mbar vácuo pressão em 40 oC.
  9. Dissolver a mistura crua com aproximadamente 1 mL de água e carregá-lo em cima da cama de gel de poliacrilamida (ver Tabela de materiais).
  10. Eluir o produto com água e coletar frações de 1 a 2 mL. Monitore as fracções recolhidas por TLC26. Lyophilize as frações (congelar o produto usando nitrogênio líquido, em seguida, coloque em Liofilizador de vácuo) para obter o produto desejado como um pó branco. Caracteriza os produtos por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares) usando D2O como solvente.

4. glicano matriz

  1. Preparação de alumínio revestido de lâminas de vidro (slide ACG) 19 , 20 , 22
    Nota: A fabricação dos slides vidro revestido de alumínio foi feita na divisão de tecnologia de película fina, centro de pesquisa de tecnologia de instrumento e nacional aplicada Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan.
    1. Embalar corrediças revestidas, vácuo-seal-los para evitar a formação de NAO e manter fechado até a reação eletroquímica de superfície-anodização.
  2. Superfície anodização de alumínio revestido de lâminas de vidro 19 , 20 , 22
    1. Definir a incubadora com temperatura controlada a 4 ° C. Preparar a solução aquosa de ácido oxálico de 0,3 M e mantê-lo em um banho de gelo. Pegue o copo de 500 mL, adicionar uma barra de agitador magnético.
    2. Transferir o ácido oxálico 0,3 M para o copo de 500 mL e em seguida, coloque uma haste 10cm longo platina como um cátodo na solução. Continue mexendo (com 300 rpm), o ácido oxálico durante todo o processo de anodização.
    3. Gire sobre o software de rastreamento de laboratório, clique sobre o botão "configurar" depois "função tensão de varredura escolha." Definir o início e parar de tensão para 25,8 V, número de pontos para 100, conformidade a 1 e varrer o atraso para 1.200 ms e clique em "okey".
    4. Grampo do vidro revestido de alumínio lado voltado para o cátodo. Clica no botão "executar teste". Observe a medição de corrente (mA ~ 8-10).
    5. Após anodização de superfície, lavar o deslize cuidadosamente com água bidestilada, purgar seco com gás nitrogênio e em seguida, armazenar em uma câmara de umidade relativa de 30% até nova utilização.
  3. Fabricação de ACG glicano microarray 22
    1. Prepare-se 100 µ l de todos os glicanos monovalentes (I-XI) em etileno glicol na concentração de 10 mM individualmente.
    2. Dilua o glicano acima com buffer de impressão (80% etilenoglicol e 20% água deionizada) para fazer a concentração de 100 µM.
    3. Para estudo de hetero-ligante, preparar 5 µ l de cada XI os glicanos e a cada um, adicione 5 µ l do homem5GlcNAc2 (proporção de 1:1).
    4. Microarrays impressão por robótico pin (ver Tabela de materiais) pela deposição de 0,6 nL dos glicanos previamente preparados para ACG slides31.
    5. Armazene os slides impressos em uma caixa seca umidade controlada antes do ensaio.
  4. Mapeamento de glicano epitopos de HIV-1 anticorpos neutralizantes amplamente PG9 22
    1. Prepare-se 1 mL BSA contido tampão PBST, 3% w/v.
    2. Preparar a 70 µ l de PG9 (50 µ g/mL) em tampão PBST (BSA contido tampão PBST, 3% p/v).
    3. Prepare-se 120 µ l de anticorpo secundário fluorescente marca burro IgG anti-humano (Alexa Fluor 647 conjugados) 50 µ g/mL de tampão PBST (BSA contido tampão PBST, 3% p/v) no escuro.
    4. Misture o anticorpo primário (PG9) e anticorpo secundário etiqueta fluorescente na proporção de 1:1 (60 µ l cada). Incube pré-misturado anticorpos durante 30 min a 4 ° C.
    5. Carrega o slide ACG na câmara de incubação de slide que é dividida em 16 poços. Transferir 100 µ l de anticorpos pré-misturados à matriz glicano e incubar a 4 ° C, durante 16 h.
    6. Pipetar para anticorpos pré-misturados. Remova a câmara de incubação do slide.
    7. Primeiro, lave o slide em tampão PBST (PBS e 0,05% Tween-20), seguido por água deionizada e rotação seca a 2.000 x g.
    8. Abra o software de análise de imagem de microarray (ver Tabela de materiais). Inserir um slide com as características de matriz virado para baixo.
    9. Clique no menu "configurações", definir a resolução de imagem de 5 µm por pixel e o comprimento de onda de 635 nm com PMT450 e poder de 100%.
    10. Clique sobre o botão "scan" para iniciar o slide de imagem.
    11. Clique no ícone de "arquivo" para salvar a imagem de varredura em formato tif.
    12. Realizar análise de imagem, seguindo guia32 do utilizador do software.
    13. Calcular a intensidade total da fluorescência e ilustram usando software33 de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais).
      Nota: Aqui, a percentagem média de erro para todos os pontos de dados é apresentado por barras de erro.

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Representative Results

Uma estratégia modular de quimio-enzimático para a síntese de um vasto leque de N-os glicanos é apresentada na Figura 1. A estratégia é baseado no fato de que a diversidade pode ser criada no início por quimioterapia-enzimático síntese dos três módulos importantes, seguido pelo mannosylation α-específicos para o 3-O e/ou 6-Ó posição do resíduo manose do comum núcleo trissacarídeo de N- os glicanos. Considerando a diversidade estrutural de bi - tri- e estruturas de tipo complexo tetra-antennary N- glicano, acreditávamos que um conjunto de oligosaccharyl doadores e o aceitador de trissacarídeos núcleo com pré-instalado alquil handlecould ser usado como começar materiais para gerar a diversidade estrutural desejada (Figura 1). A aplicabilidade dos doadores de fluoreto glycosyl na construção de uma biblioteca de complexos glicano provou anteriormente-21.

Para demonstrar a eficácia da nossa estratégia, uma estrutura isomérica bi-antennary (10, Figura 3) foi selecionada para a síntese. O D1 braço antenas 4 e D2 braço antenas 5 de glicano 10 foram gerados em larga escala por métodos enzimáticos quimio. Em particular, o dissacarídeo aceitador 1 foi enzimaticamente galactosylated usando β-1, 4-galactosyltransferase e uridina 5'-diphosphogalactose (UDP-Gal) para formar o trissacarídeo 2. Em seguida, o intermediário 2 foi fucosilado na posição 3 GlcNAc -O na presença de α-1, 3-bandas de Helicobacter pylori (Hpα1, 3 FT) para pagar o desejado Tetrassacarídeo 3. Para ligadura química ao núcleo, blocos 2 e 3 foram peracetylated primeiro, e o redução final p- metoxi fenol grupo foi removido. Finalmente, o flúor foi instalado na presença de DAST para obter o desejado módulos 4 e 5, respectivamente (Figura 2).

Tendo os módulos desejados na mão, em seguida prosseguimos com a stereoselective 3 -O glycosylation de 4 para o núcleo trissacarídeo 6 sob catálise de prata trifluormetanosulfonato e dicloreto de hafnocene para fornecer o respectivo hexasaccharide 7 (Figura 3). A proteção de benzilideno que mascaramento de 4, 6-OH foi removido usando catalítico p-tolueno sulfônico (p- TSA). Aproveitando-se de sua reatividade, 6-OH primário de 8 foi reagiu com flúor módulo 5 sob condições experimentais semelhantes para alcançar a necessária decasaccharide 9. Finalmente, desproteção global foi realizada para obter glicano 10, que caracterizou-se ainda mais usando NMR e espectroscopia de massa (Veja o arquivo de dados suplementares).

Os glicanos contendo uma cauda de amina pentil no final reduzindo foram modificados com os linkers ácidos fosfônico e anexados à superfície ACG através da química de fosfonato (Figura 4). No passado, HIV-1 bNAb PG9 foi exibido por sua especificidade glicano usando matrizes os glicanos homo e hétero para demonstrar para a primeira vez que PG9 interagiu com heteroglycans adjacentes no laço V1/V2 do HIV-1 gp120 superfície (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Uma estratégia modular geral para a preparação de N- os glicanos. (A) o número de N- os glicanos gerados por esta estratégia que comumente ocorrem em glicoproteínas humanas é estimado para exceder 20.000. (B) três tipos de módulos preparados por esta abordagem quimioterapia enzimáticos que pode ser usada para glycosylations α-seletive. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: síntese de Chemoenzymatic dos módulos. i, UDP-galactose, β 1, 4-GalT, 15 h, 86%; ii, PIB-fucose, α-1, 3-FucT, 15 h, 84%; III, Ac (1)2O, piridina, RT, 12 h; (1) lata, ACN: Tolueno: H2O (3) DAST, Cl2, CH2-30 oC. pode: nitrato de amônio cério; DAST: Trifluoreto Diethylaminosulfur.
Nomenclatura do produto: 1, pglucopyranosyl-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D--(1→ 2)-α-D-mannopyranoside; 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside; 3, p-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-I-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside - metoxifenil; 4, [fluoreto de diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl 2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-; 5, [Fluoreto de fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl 2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L- por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: química glicosilação de módulos de braço D1/D2 para aceitador do núcleo. eu, 4, AgOTf, Cp2HfCl2, tolueno, 4 Å MS, 0 óC a RT, 70%; ii, p- TSA, acetonitrilo, RT, 57%; III, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, tolueno, 4 Å MS, 0 óC a RT, 34%; iv, (1) LiOH, 1,4-dioxano: H2O; 90 oC 12 h; (2) Ac2O, piridina, 12 h; (3) Almeida, MeOH, 12 h; (4) Pd(OH)2, MeOH: H2O: HCOOH (5:3:2), H2, 36%. AgOTf: Trifluromethanesulfonate de prata; CP2HfCl2: dicloreto de háfnio Bis (ciclopentadienila), MS: peneiras moleculares, nomenclatura dos produtos: 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2- acetamido-2-Deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-Acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-Deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8, 5-Azidopentyl - O-(2-O-acetil-3,4,6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6- O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-( 1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-Deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-Benzyl-2-Deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5- Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)- Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: glicano imobilização em uma matriz ACG. (A) modificação química de glicano com amino cauda em um ácido fosfônico cauda para fixação covalente do slide ACG através da química de fosfonato. (B) distribuição dos glicanos sobre uma superfície ACG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: análise de matriz Glyan. (A) estruturas de sintético N- os glicanos que são impressas em uma matriz ACG. (B) vinculação análise de PG9 os glicanos individuais eu-XI imprimido na matriz ACG (painel esquerdo) e misturas de glicano de homem5 misturado com os glicanos eu-XI (painel direito) com concentração de 100 µM. As concentrações molares em µM para PG9 são dadas na legenda. A intensidades de sinal média e desvio-padrão calculado para cinco repetições independentes na matriz são mostrados. As inserções mostram imagens de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Uma classe de bNAbs de HIV-1, incluindo PG9 e PG16 PGTs 128, 141-145 foram relatados para ser altamente potente para neutralizar a 70-80% de isolados de HIV-1 em circulação. Os epítopos destes bNAbs são altamente conservados entre as variantes de todo o grupo HIV-1 M, portanto eles podem guiar o projeto de immunogen eficaz para uma vacina contra o HIV eliciar neutralizando anticorpos23,24,25 . Como parte dos nossos esforços em curso para identificar os epítopos glicano do HIV-1 amplamente anticorpos neutralizantes, informamos a síntese química e enzimática de um painel de alta manose, híbrido e oligossacarídeos tipo complexo para formar um glicano matriz21, 22. No entanto, as matrizes de glicano comumente usados em lâminas de vidro N- hidroxisuccinimida-revestido (NHS) são incapazes de detectar interações de carboidrato-proteína de baixa afinidade, provavelmente devido à distribuição heterogênea glicano resultante da hidrólise de reactivo N- hydroxysuccimide grupos funcionais em sua superfície. Para superar as limitações dos formatos de matriz convencional, temos desenvolvido uma matriz de glicano um slide de (ACG) de vidro revestido de óxido de alumínio. Realizamos ainda uma comparação de homogeneidade entre a matriz ACG e o NHS comumente usado matriz para provar que a matriz ACG ofereceu uma apresentação glicano mais homogênea na sua superfície22. Nossa análise preliminar de ligação não foi capaz de observar a vinculação de PG9 a qualquer um dos glicanos na matriz de NHS (dados não mostrados). Portanto, para definir a especificidade da ligação do PG9, o glicanos eu-XI estava anexado a uma cauda de ácido fosfônico e impresso no slide ACG com 100 µM dos glicanos individuais (Figura 4). A imobilização de glicano em um slide ACG através da química de fosfonato ofereceu uma distribuição mais estável e homogênea. Cada um dos glicanos foi impresso com cinco repetições e slide imagens foram obtidas de uma varredura de fluorescência após incubação de anticorpo do burro DyLight649-conjugado anti-humano IgG. A análise de ligação de PG9 para os glicanos individuais imprimidos na matriz ACG (Figura 5, painel esquerdo) sugere que PG9 fortemente interagiu com híbrido-tipo glicano (X). As interações foram também detectadas para tipo alta manose Man5 (glicano IV) e o tipo complexo glicano (XI).

As interações de nível moleculares entre PG9 e híbrido-tipo glicano (X) são difíceis de determinar devido à falta de suas informações de estrutura de cristal Co. O glicano híbrido do tipo X é composto de um braço de tipo complexo nos 3-O posição do núcleo e um braço de trimannose ligado ao 6-Ó posição do trissacarídeo central. Ligação do PG9 a híbrido glicano X sugere que PG9 requer tanto manose e ácido siálico resíduos nas proximidades para interações de alta afinidade. Para identificar a combinação de glicano que melhor se encaixa no bolso de vinculação PG9, realizamos um estudo de matriz misturado-glicano. Glicano IV foi misturado com cada glicano de eu-XI na proporção de 1:1 mole e manchado em uma matriz ACG. A análise de ligação de PG9 para cada uma das misturas indicou que uma combinação de homem5 e um SCT (IV + XI) resultou na maior afinidade para PG9 comparado ao IV ou XI sozinho. Além disso, misturas contendo homem5 e aqueles que contêm sialylated antenas, tais como os glicanos VIII e X foram também detectaram22. Pela primeira vez, estes resultados ofereceram uma prova com base em array para o comportamento de vinculação de hetero-os dos glicanos de PG9 que foi sugerido por estudos de estrutura de cristal de PG9 com o HIV-1 gp120 V1/V2 domínio23.

Em conclusão, temos demonstrado uma estratégia eficiente de quimio-enzimático modular para a preparação de altamente diverso N-ligadas a oligossacarídeos que ocorrem em glicoproteínas humanas. Além disso, o desenvolvimento de uma matriz ACG fornece que um meio eficaz determinar interações proteína-carboidrato extremamente fraco e, mais importante, as interações que ocorrem através de hetero-os glicanos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores graças a divisão de tecnologia de película fina, centro de pesquisa de tecnologia de instrumento (ITRC) e nacional aplicada Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de ciência (conceder n. A maioria dos 105-0210-01-13-01) e Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Síntese da quimioterapia-enzimático química questão 132 matrizes de glicano ACG HIV neutralizando anticorpos os N- glicanos especificidade de perfilação abordagem modular
Quimio-enzimático síntese de <em>N</em>- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil
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Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

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