Summary
هنا يصف لنا نموذجا مورين السكري رواية استخدام الفئران أصلع للرصد في الوقت الحقيقي، وغير الغازية، من عدوى الجرح بيوفيلم من طرحه الزائفة الزّنجاريّة. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتقييم العدوى الأخرى أنواع البكتيريا والكائنات الدقيقة المحورة وراثيا، بما في ذلك الأغشية الحيوية المتعددة الأنواع، واختبار فعالية استراتيجيات أنتيبيوفيلم.
Abstract
ويعتقد وجود البكتيريا كمنظم الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة، خصوصا في مرضى السكري، للحيلولة دون التئام الجروح والقرار. قد استخدمت نماذج الجروح المزمنة الماوس فهم التفاعلات الأساسية بين الكائنات الحية الدقيقة والبلد المضيف. النماذج التي وضعت حتى الآن تعتمد على استخدام الحيوانات الشعر وجمع المحطة الطرفية من أنسجة الجرح لتحديد البكتيريا قادرة على البقاء. في حين قد اكتسبت فكرة كبيرة مع هذه النماذج، يتطلب هذا الإجراء التجريبي عدد كبير من الحيوانات وأخذ العينات مضيعة للوقت. وقد وضعنا نموذجا رواية مورين الذي يشتمل على العديد من الابتكارات الأمثل لتقييم التقدم بيوفيلم في الجروح المزمنة:) فإنه يستخدم الفئران أصلع، مما يلغي الحاجة لإزالة الشعر؛ ب) ينطبق قبل تشكيل الأغشية الحيوية للجروح تسمح بتقييم فوري لاستمرار وتأثير هذه الجاليات على المضيف؛ ج) ترصد تطور بيوفيلم بالتحديد الكمي لإنتاج الضوء من سلالة طرحه المهندسة وراثيا من الزائفة الزّنجاريّة، يسمح للرصد في الوقت الحقيقي للعدوى وبالتالي تقليل عدد الحيوانات اللازمة للدراسة. في هذا النموذج، أنتجت في الجزء الخلفي الفئران أصلع السكري الناجم عن STZ جرح عمق كامل واحد وتلقيح مع الأغشية الحيوية لسلالة P. الزّنجاريّة طرحه 41 كسين. الضوء الناتج من الجروح تسجل يوميا في في فيفو نظام التصوير، بما يسمح للتصور بيوفيلم السريع في فيفو و في الموقع وتوطين البكتيريا بيوفيلم داخل الجروح. يعد هذا الأسلوب رواية مرنة كما يمكن استخدامها لدراسة الكائنات المجهرية الأخرى، بما في ذلك الأنواع المحورة وراثيا، والأنواع المتعددة من الأغشية الحيوية، وقد تكون ذات قيمة خاصة في اختبار استراتيجيات مكافحة بيوفيلم بما في ذلك مضادات الميكروبات الضمادات الانسداد.
Introduction
الأغشية الحيوية هي مجتمعات معقدة من الكائنات الحية الدقيقة جزءا لا يتجزأ من مصفوفة مواد البوليمرية التي تم إبرازها عاملاً مساهما للقرار الفقراء من الجروح المزمنة1. دراسة هؤلاء السكان الميكروبية عالية التنظيم، واستمرار أهمية خاصة لمرضى السكري حيث يؤدي ضعف الدورة الدموية على أطرافه وتغيير الآليات الحسية الطرفية للآفات التي لم يتم كشفها2. في الولايات المتحدة، ويقدر أن 15% مرضى السكري بوضع قرحة واحدة على الأقل أثناء حياتهم. وهذا يترجم إلى نفقات اقتصادية بحوالي 28 بیلیون دولار في المعاملة3،4، ناهيك عن العبء العاطفي والاجتماعي إيمينسورابل. فهم العوامل التي تسمح للمجتمعات الميكروبية على المثابرة في قاع الجرح والأثر الذي تحدثه هذه الأغشية الحيوية في أحداث الشفاء لا بد من محرك تحسين الرعاية للمرضى المتضررين ودفع تطوير نهج معاملة جديدة. ولذلك، إنشاء نماذج قابل للنقل واستنساخه في فيفو لاستكشاف التفاعلات البكتيرية-المضيف أمر بالغ الأهمية.
-تم تطوير نماذج مورين بنجاح لدراسة تأثير الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة. هذه النماذج، ومع ذلك، غالباً ما الاستفادة من أنواع الشعر وتقييم إزالة بيوفيلم بتهم لوحة للخلايا البكتيرية قابلة للاستمرار من الأنسجة قصت من الحيوانات التضحية، يجعلها تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة.
كان أول من اقترح بديلاً بيوفوتونيك لأخذ عينات من الحيوانات في تقييم الإصابة نقطة نهاية كونتاج وآخرون. (1995) 5 ، الذين وضعت طريقة لالتقاط التﻷلؤ من طرحه مؤثرا typhimurium السالمونيلا لقياس مدى فعالية العلاج بالمضادات الحيوية. اتبعت الدراسات الأخرى الاستفادة من البكتيريا التي تنبعث منها الإضاءة الحيوية. على سبيل المثال، روشيتا وآخرون. (2001) 6 التحقق من صحة نموذج عدوى لدراسة الإشريكيّة القولونية الفخذ العدوى في الفئران عن طريق قياس التﻷلؤ باستخدام جهاز اقتران مكثفة وفي وقت لاحق، كادوروجامووا وآخرون. (2003) 7 استغل فوتون انبعاث خصائص عبئا هندسيا ل المكوّرات العنقودية الذهبية للتحقيق في مدى فعالية المضادات الحيوية عدة في نموذج جرح قسطرة في الفئران.
ويعرض الأسلوب يتميز هنا بروتوكولا مباشرة للحث على مرض السكري في الفئران أصلع وإنتاج وتطعيم الجروح مع الأغشية الحيوية طرحه قبل المشكلة من P. الزّنجاريّة، والقيام بعمليات رصد بيوفوتونيك العدوى باستخدام في فيفو نظام التصوير. ويوفر المباشر، السريع، في عين المكان، والعملية غير الغازية والكمي لتقييم الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة وعلاوة على ذلك، يسمح للتحليل إضافية مثل التصوير المجهري لشفاء الجروح، جمع الدم المتقطع سيتوكين القياسات، وجمع الأنسجة الطرفية لعلم الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
التجارب على الحيوانات وقد أقر برعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام من جامعة ولاية ميشيغان.
1-إعداد الضمادات الانسداد والفواصل سيليكون
- قطع الملابس الانسداد شفافة لجعل مربعات تقريبا 1 سم × 1 سم مع المقص.
- قطع 10 مم دوائر على ورقة سميكة سيليكون 0.5 مم استخدام 10 ملم خزعة لكمه. مركز خزعة 5 مم لكمه في منتصف الدائرة 10 ملم واضغط بشدة لخلق ثقب للنموذج " دونات "-مثل القرص التي سيتم استخدامها كجبيرة.
2-"الحيوانات التجريبية"
- استخدام القديم الأسبوع 8 (22-26 ز) ذكور الفئران سخ-1 من مربي تجاري. تبقى الفئران في الظروف القياسية 21 درجة مئوية ودورة ضوء الظلام ح 12 مع حرية الوصول إلى الغذاء والمياه-
- للحث على مرض السكري، حقن الفئران إينترابيريتونيالي مع سولوتيوناند بالستريبتوزوتوسين (STZ) 13 ملغ/مل 25% جلوكوز (250 ميليلتر الواحد/الماوس) في 5 أيام متتالية.
- جعل الحل STZ بتمييع ميكروغرام 65 من STZ في 5 ميليلتر من 100 ملم حمض الستريك، الأس الهيدروجيني 4.5.
- ضبط حجم حقن لكل الماوس إلى كتلة نهائية من 65 ملغ STZ لكل 1 كغم من وزن الجسم الماوس. حقن الفئران التحكم مع 100 ملم حمض الستريك الحل الأس الهيدروجيني 4.5 في الأيام نفسها.
- تأكيد ارتفاع السكر في الدم عن طريق الدم الجلوكوز الرصد مع السكر مدة 14 يوما بعد آخر حقن STZ. الفئران السكري قد يكون التبول وحتى تلك الأسرة قد تحتاج إلى تغيير أكثر تواترا لإزالة الرطوبة واوزانها وينبغي رصد 3 مرات في أسبوع.
3. الأغشية الحيوية
- إعداد بيوفيلم
- تنمو مستعمرة الأغشية الحيوية 8 لتطعيم الجروح. يومين قبل بدء الجراحة بثقافة بين عشية وضحاها من طرحه المحتضنة كسين P. الزّنجاريّة 41 في مرق الصويا تريبتيك (TSB) عند 37 درجة مئوية وتهز 200 لفة في الدقيقة وتعقيم الفلاتر غشاء البولي مع حجم المسام ميكرومتر 0.2 بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في غطاء سلامة بيولوجية لمدة 15 دقيقة كل جانب.
- يوم واحد قبل الجراحة الطرد المركزي الثقافة بين عشية وضحاها في 20,000 س ز 2 دقيقة ويغسل 3 مرات مع 1 مل دولبيلككو ' s الفوسفات مخزنة المالحة (دببس) من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- تمييع تعليق في دببس إلى امتصاص 0.05 في 600 نانومتر.
- ماصة 10 ميليلتر ثقافة المخفف في كل غشاء يستريح على طبق أجار (TSA) تريبتيك فول الصويا. وبعد السماح لتجف، احتضان الأغشية في 35 درجة مئوية ح 72 نمو الأغشية الحيوية نقل إلى الطازجة حساب السياحة الفرعي لوحات كل حاء 24
- المنحنى المعياري
- قبل البدء التجربة تجعل من منحنى المعياري لربط حساب الإضاءة الحيوية والبكتيرية.
- إعداد الأغشية الحيوية كما هو موضح في 3-1-
- جعل تخفيف المسلسل للأغشية الحيوية بدءاً من ½ إلى 1/24 بخلط بيوفيلم مع دببس وفورتيكسينج حتى تنتج حلاً بصريا متجانسة. ماصة 200µL الحلول المخففة في لوحة 96-بئر أسود والصورة مع في فيفو نظام التصوير-
- تنتشر تخفيف لوحة على لوحات حساب السياحة الفرعي واحتضان في 35 درجة مئوية ل 24 h.
- عد مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) على لوحات وإنشاء منحنى قياسي لربط حساب الإضاءة الحيوية والبكتيرية.
4. جرح جراحة
- حمل التخدير العام باستخدام إيسوفلوراني في 95% oxygen/5% CO 2 (لمنع الموت من ketoacidosis) بمعدل تدفق من 1 لتر في الدقيقة والحفاظ على التخدير باستخدام إيسوفلوراني 1-3%. الحفاظ على الحيوانات على حصائر الحرارة أثناء الجراحة.
- ضمان ردود الفعل العميقة دواسة الماوس تقمع معسر في القدم مع ملاقط ووضع الماوس في المكان المعرضة.
- إدارة ميلوكسيكام (0.2 مغ/كغ) عن طريق الحقن الجلدية الفرعية (30 ميكروليتر) لإدارة الألم.
- يمسح الجلد من الخلف مع 10% بوفيدون ثلاث مرات وجهاز pad الايزوبروبانول.
- استخدام لكمه خزعة عقيمة 4 مم للمخطط التفصيلي نمط دائري واحد للجرح على جانب واحد من الماوس ' s خط الوسط على مستوى الكتفين. المخطط التفصيلي النمط مع علامة دائمة-
- استخدام ملقط مسنن لرفع الجلد في وسط المقص المخطط التفصيلي وقزحية العين لإنشاء كامل-سمك جرح الذي يمتد عبر النسيج تحت الجلد بما في ذلك كارنوسوس بانيكولوس والمكوس قطعة دائرية من الأنسجة.
- تطبيق غراء لاصق طبي جلد لماء على جلد الفئران ووضع جبيرة سيليكون تطبيق ضغط خفيف. تغطية الجرح مع خلع ملابس انسداد شفافة. بعد الجراحة، فردياً قفص الحيوانات-
5. إدارة ما بعد الجراحة
- إدارة ميلوكسيكام (0.2 مغ/كغ) مرة واحدة يوميا عن طريق الحقن الجلدية الفرعية لتخفيف الألم بعد العمليات الجراحية للأيام القادمة 2-
- مراقبة الحيوانات يوميا لمظاهر الألم وفقدان الوزن. السكري الحيوانات بحاجة إلى حقن الأنسولين عند فقد 15% أو أكثر من وزن الجسم.
6. إعداد بيوفيلم العدوى والإصابة
- تلقيح الفئران 48 ساعة بعد الجراحة كما هو موضح في الخطوات التالية. وضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي
- ح 72 كشط الأغشية الحيوية من الأغشية استخدام ملعقة عقيمة، وتمييع 1:2 في دببس. مزيج من بيبيتينج بإيجاز صعودا وهبوطاً.
- لوحة انتشار العدوى على لوحات حساب السياحة الفرعي لحساب مجموع زيمبابوي. للتأكد من أن التهم الموجهة إليه دقيقة، كسر العدوى بيوفيلم كذلك بسلسلة من خطوتين فورتيكسينج 1 دقيقة أولمبية صيفية بخطوة سونيكيشن 2 دقيقة في 40 كيلو هرتز في منظف الموجات فوق الصوتية-
- إزالة تغطي تضميد الجرح وسيليكون جبر وتتخذ صورة مجهرية من الجرح مجهر مع الكاميرا المرفقة باستخدام مسطرة للرجوع إليها.
- قص النصائح من 200 ميليلتر ماصة نصائح و "الماصة؛" 10 ميليلتر من العدوى بيوفيلم على كل الجرح.
- صورة الماوس استخدام في فيفو التصوير النظام باستخدام الإعدادات التلقائية: التعرض مرة ثانية 5-300، مع binning المتوسطة، و 1/إيقاف وتصفية مفتوحة، ومجال الرؤية ج (12.9 سم x 12.9 سم).
- تغطية الجرح بخلع الملابس الطازجة.
7. جرح قياس وتصوير
- تقييم علامات سريرية للحيوانات اليومي 9.
- توفير الغذاء والمياه وتغيير الأقفاص حسب الحاجة.
- الاختيار سلامة الضمادات يوميا. عند خلع الملابس، يمكن أن يقاس إلا الإضاءة الحيوية بسبب انسداد الجرح. في يوم 8، تتم إزالة الضمادات ولا يحل محل القياس مما يسمح لإغلاق الجرح.
- وزن الحيوانات كل يوم-
- لجميع الأيام، مكان الفئران منفردة في تشكيل غرفة عزلة مزودة بفلتر HEPA والصورة باستخدام في فيفو نظام التصوير يوميا أو كل يوم حتى قيم استضاءة تقل مستوى الخلفية.
- بعد يوم 8، الحث على التخدير العام واتخاذ ميكروجرافس للجرح مع مجهر مع الكاميرا المرفقة باستخدام مسطرة للرجوع إليها في كل يوم حتى تلتئم الجراح.
8. التحليل النسيجي
- يوثانيزي الفئران مع تدفق 2 لتر في الدقيقة من CO 2 في القتل رحيم الدائرة بعد التﻷلؤ يقع أسفل مستويات الخلفية وتلتئم الجراح تماما. تأكيد وفاة بخلع عنق الرحم كطريقة ثانية للقتل الرحيم.
- استخدام مقص آيريس لختان الإناث على نطاق واسع، وكامل حول وتحت منطقة الجرح (حوالي 1 سم في القطر) إنشاء والحفاظ على الأنسجة في بارافورمالدهيد 4% للتحليل النسيجي.
- أخرى تحليل: الكشف عن سيتوكين
- جمع الدم الرجعية-أوربيتالي من الحيوانات تحت التخدير استخدام أنبوب زجاج شعرية وتحويلها إلى أنابيب المعالجة يدتا.
- الطرد المركزي الدم 2,000 لفة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجميد البلازما للكشف عن سيتوكين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في وضع هذا النموذج الجديد، لاحظنا العديد من المزايا في استخدام أصلع سخ-1 على الفئران C57BL/6J، التي كنا قد استخدمت في الماضي. الحيوانات التي تخضع للحقن STZ عادة تجربة فقدان الوزن تدريجيا مع بداية مرض السكر؛ ومع ذلك، في الجرح الشفاء التجارب سابقا أجرتها مختبراتنا استنساخ النموذج الذي قدمه دن وآخرون. (2012) وقد لوحظ 9 استخدام C57BL/6J، الحاد وفقدان الوزن (الشكل 1). على النقيض من ذلك، عند استخدام هذا الجرح بنموذج مع الفئران سخ-1 لوحظ فقدان وزن انخفاض يعتد به إحصائيا (P < 0.0001، اختبار مان-ويتني U). وعلاوة على ذلك، لم تحدث وفيات حدثت في الفوج الفئران سخ-1 السكري المصابين P. الزّنجاريّة 41 كسين الأغشية الحيوية بينما لوحظ معدل وفيات 40% للفئران C57BL/6J المصابة في التجارب السابقة (الشكل 2).
وهناك ميزة أخرى للنموذج المعروض هنا أن الإجراء التجريبي لإزالة الشعر خطوة إلزامية بالنسبة للفئران C57BL/6J لا لزوم لها للفئران سخ-1. على الرغم من أن في تجاربنا السابقة مع الفئران الشعر تم إيلاء اهتمام خاص لتقليل تهيج الجلد، حدث بعض الأضرار لا محالة (الشكل 3). جدير بالذكر أن أكبر ميزة في استخدام الفئران أصلع في هذا النموذج غير أن القضاء على مشكلة إعادة نمو الشعر في المدى الطويل الجرح الشفاء الدراسات. في تجربتنا مع الفئران C57BL/6J، إعادة نمو الشعر تختلف من الحيوان للحيوان ولكن نظراً للطبيعة الطويلة الأجل للدراسات، دائماً حدث وتدخلت مع قياسات منطقة الجرح أو الجرح خلع الجبائر و/أو الضمادات المستخدمة لتغطية المصابين الجروح، مما يحتمل أن تكون في تجفيف الجرح (الشكل 4).
في طراز سخ-1 الجرح الشفاء، بعد تأكيد السكري، جراحة يمكن بسهولة تنفيذها لإنشاء تعميم كامل-سمك الجرح في الجزء الخلفي الحيوان. جبيرة سيليكون يتم الاحتفاظ بها في مكان بمادة لاصقة طبية من جلد لماء وتجنب الاتصال المباشر من خلع الملابس الانسداد مع السرير الجرح الذي تم إنشاؤه حديثا (الشكل 5).
P. الزّنجاريّة 41 كسين طرحه نمت على أغشية البولي (الشكل 6) الأغشية الحيوية بسهولة وأسيبتيكالي تنقل إلى حقنه تكون على استعداد للتسليم بالجروح والفئران الملقحين تخضع يوميا السريري علامات للعدوى (الشكل 7). لهذا النموذج، قمنا بتنفيذ مرحلتين متميزتين. في المرحلة الأولى، بعد التطعيم بيوفيلم الجرح محاط جبيرة مغطاة خلع ملابس انسداد شفافة. هذا يؤدي إلى تراكم الصديد التي تغطي الجرح. تم تصويرها الجروح المحتوية على بيوفيلم يوميا مع في فيفو التصوير نظام رصد الإصابة بالتنمية وتقييم تطور بيوفيلم (الرقم 8 و الرقم 9). يمكن أن يرتبط الإضاءة الحيوية، سجلت كمجموع الجريان (p/s)، بالكثافة البكتيرية باستخدام منحنى قياسي (الشكل 10).
في يوم 8، أزيلت في جبيرة وخلع الملابس للسماح للتصور لالتئام الجروح. قطرات الإضاءة الحيوية في وقت لاحق نظراً لفقدان صديد المحيطة بالجرح؛ ومع ذلك، البكتيريا ظلت مقترنة بالجرح كما يحدده علم الأنسجة. وقد استخدمت هذا الأسلوب لإزالة الملابس لقياس التئام في الجروح المزمنة الأخرى شفاء الدراسات (الحكام). يمكن تحديد الجرح الشفاء التقدم عن طريق اتخاذ ميكروجرافس مع كاميرا مرفقة مجهر (الشكل 11).
رقم 1: مقارنة النسبة المئوية لتخفيف الوزن من الفئران السكري سخ-1 و C57BL/6J- صفر يوم حقن STZ يطابق الوزن في اليوم الأخير (5th). n = 10 الفئران سخ-1 و n = 12 من الفئران ل C57BL/6J. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: معدلات بقاء نسبة من الفئران السكري سخ-1 و C57BL/6J بعد تطبيق بيوفيلم كسين P. الزّنجاريّة 41 (اليوم الأول)- n = 5 الفئران سخ-1 و n = 10 الفئران ل C57BL/6J. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: جرح الجلد تمزقات في المستقبل المنطقة بعد الحلاقة واستخدام كريم مزيل الشعر على الفئران C57BL/6J- (أ): يوم الداخلي؛ (ب): 4 أيام بعد الإجراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: (أ) C57BL/6J الماوس مع على جبيرة جرح إزالتها جزئيا. (ب) رفع جبيرة كشفت جرح تلتئم محاطة بالكامل إعادة زراعة الشعر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 5: إجراء العمليات الجراحية لإصابة الفئران سخ-1- (أ) ترسيم الحدود مع كمة خزعة؛ (ب) الخطوط العريضة لعملية ترسيم الحدود؛ (ج) جرح الانتهاء؛ (د) تطبيق لاصقة طبية من الجلد للماء؛ (ﻫ) التغرية جبيرة؛ (و) الجرح مغطى بخلع الملابس الانسداد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: إعداد العدوى بيوفيلم- (أ) ح 72 مستعمرة الأغشية الحيوية كسين الزائفة الزّنجاريّة 41 نمت على أغشية البولي؛ (ب) قياس بيوفيلم استخدام الخميسجنرال الكتريك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: 1 سخ السكري الماوس 6 أيام بعد أن تم تلقيح الجرح مع بيوفيلم كسين P. الزّنجاريّة 41- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: رصد العدوى بيوفيلم بتتبع تطور الإضاءة الحيوية مع مرور الوقت في السكري سخ-1 الفئران. (أ) يوم بيوفيلم التطبيق؛ (ب) 5 أيام بوست-بيوفيلم؛ (ج) 8 أيام بوست-بيوفيلم؛ (د) 12 يوما وظيفة-بيوفيلم؛ (ه) أيام 16 وظيفة-بيوفيلم؛ بعد 20 يوما (F)-بيوفيلم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: مجموع التدفق من الجروح في الفئران السكري سخ-1 مصاب مع الأغشية الحيوية كسين P. الزّنجاريّة 41 خلال فترة التجربة- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 10: تقدر زيمبابوي كل الجرح باستخدام منحنى قياسي للإضاءة الحيوية في زيمبابوي تنتج مع الأغشية الحيوية كسين P. الزّنجاريّة 41- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 11: صورة مجهرية التسلسل الزمني للجروح المصابين كسين P. الزّنجاريّة الأغشية الحيوية 41 في السكري الماوس سخ-1 عرض التقدم للشفاء. أيام بعد الإصابة بيوفيلم مبينة في الركن الأيسر السفلي لكل صورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا نموذج ماوس جديد لدراسة الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة السكري يحتوي على العديد من المزايا لإنشاء نموذج استنساخه، والترجمة، ومرنة.
الابتكار الأول هو استخدام الفئران أصلع. -تم تطوير نماذج الماوس الأخرى لدراسة السكري الجرح المزمن شفاء10،11، ولكن كل ما كانت تعتمد على استخدام الشعر الفئران التي تتطلب إزالة الفراء من العمليات التي تنطوي على الصبح أو قص الشعر جنبا إلى جنب مع كريمات. هذه الخطوة ليس فقط مضيعة للوقت وفوضوي ولكن يحتمل أن يضر بجلد الحيوانات في المنطقة حيث سيتم وضع الجرح. في حين استخدمت الفئران أصلع في سلسلة من دراسات التسرطن12،13، استخدمت لا هذه الفئران لتقييم استمرار بيوفيلم في الجروح المزمنة. مشكلة مشتركة أخرى حلها باستخدام الحيوانات أصلع، ولا سيما في الدراسات طويلة الأجل، وهو إعادة نمو الشعر في منطقة الجرح، مما قد يعرض للخطر تقييم التئام الجروح وتعطيل الضاغطة.
الحيوانات سخ-1 كما أثبتت أنها قابلة لفعل STZ النوع الأول من مرض السكري، ومقارنة بالفئران C57BL/6J، كان انخفاض يعتد به إحصائيا وفقدان الوزن خلال فترة التجربة، مما يجعل الجرعات مع الأنسولين لا لزوم لها. وهذا سمة مثيرة لاهتمام لا سيما العلاج بالانسولين يمكن أن يحتمل أن تؤثر نتائج الإصابة كما يتضح بها واترز et al (2014)14 الذي وصف زيادة في التهم البكتيرية في المعالجة بالانسولين السكري الحيوانات المصابة مع P. الزّنجاريّة الأغشية الحيوية بالمقارنة بنظرائهم الأنسولين لا. وباﻹضافة إلى ذلك, في نموذجنا، كان هناك انخفاض حاد في معدلات الوفيات في الفوج أصلع تشير إلى أن الحيوانات التي يحتمل أن تكون أكثر مرونة في التعامل مع الإصابة.
وسمه ثانية لهذا النموذج هو تطبيق الملاط العدوى بيوفيلم قبل وحدات قياس لتصيب الجروح وعلى النقيض من الخلايا المزروعة العوالق. بتسليم جماعة بكتيرية الفعل أيضي المعقدة والمركبة للجرح، الخلايا البكتيرية قادرين على التهرب من نظام المناعة ويمكن تحديد الآثار المباشرة للأغشية الحيوية على الآفات.
الميزة الثالثة لهذا النموذج الجديد من الجرح هو استخدام سلالات جرثومية قادرة على إنتاج الإضاءة الحيوية التي يمكن أن يقاس مع في فيفو التصوير النظام تعريب مكانياً والتحديد الكمي للبكتيريا. وهذا ما يسمح في الوقت الحقيقي تتبع تطور بيوفيلم على مر الزمن. سلالة 41 كسين P. الزّنجاريّة يملك نسخة مستقرة واحدة من مشغل لومينيسسينسيس P. لوكسكدابي على كروموسوم البكتيريا التي ينتج عنها انبعاث التأسيسي التﻷلؤ، التي يمكن التقاطها بواسطة الكاميرا حساسة جداً في نظام التصوير. تسمح هذه الميزة في الوقت الحقيقي، وغير الغازية، في الموقع لقياس بيوفيلم بالإضاءة الحيوية حتى حين جبيرة والغطاء في المكان. هذه الميزة جذري يقلل عدد الحيوانات اللازمة للدراسة، كما لا حاجة إلى التضحية بالحيوانات في نقاط زمنية معينة لرصد بيوفيلم. ومع ذلك، وجود بيوفيلم وصديد تغطي قياس التئام الجروح. في هذه الدراسة، ازلنا خلع الملابس في اليوم الثامن للسماح للتصور لالتئام الجروح، ولكن يمكن تعديل هذه المعلمة اعتماداً على الأسئلة التي يجري تناولها.
أخيرا، كما قادرة على اكتشاف الإضاءة الحيوية تصل إلى نظام التصوير 2.5 سم في العمق، والنموذج المقترح حديثا قابلة للاختبار من العلاجات المضادة للميكروبات سواء كانت في شكل من أشكال الحل أو الهلام أو مدمجة للضمادات الانسداد. يسمح نموذج عدوى في الوقت الحقيقي رصد قدر أكبر من المرونة لقياس تأثير التركيزات الجرعات المختلفة والمدد الزمنية مقارنة مقايسة نقطة نهاية ثابتة. هذا النموذج يمكن أن يسهم في التحقق من صحة علاجات رواية المحتملة لاستئصال الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر "جمعية السكري الأمريكية" لدعم هذا العمل (منحة # #7-13-بكالوريوس-180)، "ميشيغان الدولة جامعة بحوث التكنولوجيا دعم المرفق" لتوفير التدريب والوصول إلى في فيفو نظام التصوير ميشيغان الدولة جامعة التحقيق الأنسجة معمل لتجهيز خزعات الماوس لدراسة نسيجية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al.
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
