Summary
Her beskriver vi en roman diabetisk murine model udnytte hairless mus for real-time, ikke-invasiv overvågning af biofilm sårinfektioner af en bioluminescerende Pseudomonas aeruginosa. Denne metode kan tilpasses til at evaluere infektion af andre bakteriearter og genetisk modificerede mikroorganismer, herunder flere arter biofilm, og teste effekten af antibiofilm strategier.
Abstract
Tilstedeværelse af bakterier som struktureret biofilm i kroniske sår, især hos diabetikere, menes at hindre sårheling og opløsning. Kroniske sår musemodeller har været brugt til at forstå de underliggende samspil mellem mikroorganismer og værten. De modeller udviklet til dato er afhængige af brugen af hårede dyr og terminal samling af sår væv til bestemmelse af levedygtige bakterier. Mens betydelig indsigt er opnået med disse modeller, denne eksperimentelle procedure kræver et stort antal dyr og prøvetagning er tidskrævende. Vi har udviklet en roman murine model, der indeholder flere optimal nyskabelser for at evaluere biofilm progression i kroniske sår: en) det udnytter hairless mus, eliminerer behovet for hårfjerning; b) gælder præformerede biofilm på sår, gør det muligt for den umiddelbare vurdering af persistens og virkningen af disse Fællesskaber på vært; c) overvåger biofilm progression af kvantificere lys produktion af en genetisk manipuleret en bioluminescerende stamme af Pseudomonas aeruginosa, giver mulighed for tidstro overvågning af infektionen dermed reducere antallet af dyr kræves pr. undersøgelse. I denne model, er en enkelt fuld-dybde sår produceret på bagsiden af STZ-induceret diabetisk hairless mus og podes med biofilm af P. aeruginosa en bioluminescerende stamme Xen 41. Lyseffekten fra sårene registreres dagligt i en i vivo imaging system, giver mulighed for i vivo og i situ hurtige biofilm visualisering og lokalisering af biofilm bakterier inden for sår. Denne nye metode er fleksibel, da det kan bruges til at studere andre mikroorganismer, herunder genetisk modificerede arter og flere arter biofilm, og kan være af særlig værdi i anti-biofilm teststrategier herunder antimikrobiel okklusiv forbindinger.
Introduction
Biofilm er komplekse samfund af mikroorganismer indkapslet i en matrix af polymere stoffer, der er blevet fremhævet som en medvirkende faktor for den dårlig opløsning af kroniske sår1. Studiet af disse meget organiseret, vedvarende mikrobielle populationer er særligt vigtigt for hvor dårligt blodomløb på lemmer og ændrede perifer sensorisk mekanismer føre til uopdaget læsioner2-diabetikere. I USA anslås det, at 15% af diabetespatienter vil udvikle mindst ét sår i løbet af deres liv. Dette svarer til en økonomisk udgift for omkring 28 milliarder dollars i behandling3,4, for ikke for at nævne de immensurable følelsesmæssige og sociale byrder. Forstå de faktorer, der giver mulighed for mikrobielle samfund at fremture i såret seng og disse biofilm indvirkning i de helbredende begivenheder er bydende nødvendigt at køre bedre pleje for ramte patienter og drive udviklingen af nye behandlingsmetoder. Etablering af reproducerbar og oversætbare i vivo modeller for at udforske bakteriel-værtssammenspil er derfor altafgørende.
Blevet udviklet murine modeller for at studere virkningerne af biofilm i kroniske sår. Disse modeller, men ofte udnytte hår arter og evaluere biofilm clearance af plade tæller for levedygtige bakterieceller skåret væv fra ofrede dyr, hvilket gør dem tidskrævende og dyrt.
Et biophotonic alternativ til slutpunktet prøveudtagning af dyr i evaluering infektion blev først foreslået af Contag mfl. (1995) 5 , der har udviklet en metode til at fange luminescence fra constitutively en bioluminescerende Salmonella typhimurium at måle antibiotisk behandling virkning. Andre undersøgelser, at drage fordel af bioluminescens energieffektiv bakterier fulgt. For eksempel Rochetta mfl. (2001) 6 valideret en infektion model for at studere Escherichia coli låret infektioner i mus ved at måle luminescence ved hjælp af en øget afgift - sammen enhed og senere, Kadurugamuwa mfl. (2003) 7 benyttede sig af den photon udsender egenskaber af en manipuleret stamme af Staphylococcus aureus at undersøge effekten af flere antibiotika i et kateter sår model i mus.
Metoden kendetegnet her præsenterer en enkel protokol for at fremkalde diabetes i hairless mus, producere og podes sår med præ-dannet en bioluminescerende biofilm af P. aeruginosa, og gennemføre biophotonic overvågning af infektionen ved hjælp af en i vivo imaging system. Det tilbyder en direkte, hurtig, i situ, non-invasiv og kvantitative proces at evaluere biofilm i kroniske sår og derudover giver mulighed for yderligere analyse, såsom mikroskopisk billeddannelse af healing sår, intermitterende blod samling for cytokin målinger, og terminal væv indsamling til histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dyreforsøg blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Michigan State University.
1. forberedelse af okklusiv dressinger og silikone afstandsstykker
- skære den gennemsigtige okklusiv dressing til at gøre firkanter ca 1 cm x 1 cm med saks.
- Skæres 10 mm cirkler på 0,5 mm tykt silikone ark ved hjælp af en 10 mm biopsi punch. Center en 5 mm biopsi punch i midten af 10 mm cirkel og tryk fast til at skabe et hul til at danne en " doughnut "-som disk, der skal bruges som en skinne.
2. forsøgsdyr
- Brug 8 uger gamle (22-26 g) mandlige SKH-1 mus fra en kommerciel avlsdyr. Holde mus i standardbetingelser for 21 ° C og en 12-timers lys-mørke cyklus med fri adgang til mad og vand.
- For at fremprovokere diabetes, injicere mus intraperitonially med en 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand 25% glukose (250 µl pr. / mus) på 5 dage i træk.
- Gøre STZ løsning ved at fortynde 65 µg STZ i 5 µL af 100 mM citronsyre, pH 4.5.
- Justeres injiceres lydstyrken for hver mus til en endelige masse 65 mg STZ pr. 1 kg af musen kropsvægt. Injicere kontrol mus med 100 mM citronsyre løsning pH 4.5 på de samme dage.
- Bekræfte hyperglykæmi ved blod glucose overvågning med en glucometer 14 dage efter den sidste STZ injektion. Diabetisk mus kan have polyuri og så deres sengetøj skal muligvis ændres oftere til at fjerne fugt og deres vægte bør overvåges 3 gange om ugen.
3. Biofilm
- Biofilm forberedelse
- vokse koloni biofilm 8 til podes sår. To dage før operationen start en overnight kultur af en bioluminescerende P. aeruginosa Xen 41 i tryptic soja bouillon (TSB) inkuberes ved 37 ° C og ryster på 200 rpm og sterilisere polycarbonat membranfiltre med 0,2 µm porestørrelse af eksponering for UV- lys i en biologisk sikkerhed hætte til 15 min. pr. side.
- En dag før kirurgi centrifugeres overnight kultur på 20.000 x g for 2 min og vask 3 gange med 1 mL af Dulbelcco ' s fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) af pipettering op og ned.
- Fortyndes suspension i DPBS til en absorbans på 0,05 på 600 nm.
- Afpipetteres 10 µL af de fortyndede kultur på hver membran hvile på en tryptic soja agar (TSA) plade. Efter gør det muligt at tørre, inkuberes membraner på 35 ° C for 72 h at vokse biofilm overførsel til frisk TSA plader hver 24 h.
- Standardkurven
- forud for begyndelsen af eksperimentet foretage en standardkurve at korrelere bioluminescens og bakteriel tæller.
- Forberede biofilm, som beskrevet i punkt 3.1.
- Gøre serielle fortyndinger af biofilm spænder fra ½ til 1/24 ved at blande biofilm med DPBS og vortexing, indtil en visuelt homogene løsning er produceret. Pipette 200µL af de fortyndede løsninger i en sort 96-brønd plade og billede med i vivo imaging system.
- Sprede plade fortyndinger på TSA plader og inkuberes ved 35 ° C til 24 h.
- Regne plader kolonidannende enheder (CFU) og oprette en standardkurve for at korrelere bioluminescens og bakteriel tæller.
4. Sår kirurgi
- fremkalde generel anæstesi hjælp isofluran i 95% oxygen/5% CO 2 (for at undgå døden fra Ketoacidose) med en væskehastighed på 1 L/min og vedligeholde anæstesi ved hjælp af 1-3% isofluran. Vedligeholde dyr på varme måtter under kirurgi.
- Sikre de dybe pedal reflekser af musen er undertrykt ved at klemme foden med en pincet og placere musen i den liggende position.
- Administrere meloxicam (0,2 mg/kg) via sub-kutant injektion (30 μl) til smertebehandling.
- Tørre huden på ryggen med 10% povidon-jod tre gange og en isopropanol pad.
- Bruger en steril 4 mm biopsi punch for at skitsere et cirkulært mønster for sår på den ene side af musen ' s midterlinjen på niveau med skuldrene. Skitsere mønsteret med en permanent markør.
- Brug savtakket pincet til at løfte huden midt i dispositionen og iris saksen til at oprette en fuld-tykkelse sår, der strækker sig gennem det subkutane væv, herunder panniculus carnosus og punktafgifter den cirkulære stykke væv.
- Anvender en medicinsk vandtæt hud selvklæbende lim på huden af mus og Placer silikone skinne anvendelse mildt pres. Dække såret med en gennemsigtig okklusiv forbinding. Efter kirurgi, individuelt bur dyrene.
5. Postoperativ administration
- administrere meloxicam (0,2 mg/kg) én gang dagligt via sub-kutant indsprøjtning til postoperativ smertelindring for de næste 2 dage.
- Skærm dyr dagligt til manifestationer af smerter og vægttab. Diabetisk dyr har brug for insulininjektioner, når de har mistet 15% eller mere af kropsvægten.
6. Biofilm inokulum forberedelse og infektion
- podes mus 48 timer efter operationen, som beskrevet i de følgende trin.
- Skrab 72 h biofilm fra membraner med en steril spatel, placere den i microcentrifuge rør og fortyndes 1:2 i DPBS. Blanding af kort pipettering op og ned.
- Spredning plade inokulum på TSA plader til at beregne total CFU. For at sikre, at tæller er nøjagtig, nedbryde biofilm inokulum yderligere af en række to 1 min vortexing trin imidlerid for en 2 min sonikering trin på 40 kHz i en ultralydsrenser.
- Fjerne dressing dækker såret og silikone splint og tage en Mikrograf af såret med et mikroskop med vedlagte kameraet ved hjælp af en lineal for reference.
- Klippe spidserne af 200 µL pipette tips og tilsæt 10 µL af biofilm inokulum på hver sår.
- Billede mus bruger i vivo imaging system ved hjælp af auto-indstillinger: eksponering tid 5-300 s, med medium binning, 1 f-stop og åbent filter og synsfelt C (12.9 cm x 12.9 cm).
- Dækker såret med frisk dressing.
7. Såret måling og Imaging
- evaluere de kliniske tegn på dyr daglige 9.
- Give mad, vand og ændre bure resultatfilen.
- Kontrollere integriteten af forbindinger dagligt. Når bandagen er til stede, kan kun bioluminescens måles på grund af okklusion af såret. På dag 8, forbindinger fjernes og ikke erstattet tillader måling af sår lukning.
- Vejer dyr hver anden dag.
- For alle dage, placere mus individuelt i en isoleret kammer udstyret med et HEPA filter og billed benytter den i vivo imaging system dagligt eller hver anden dag indtil luminescence værdier falder under baggrundsværdien.
- Efter dag 8, fremkalde generel anæstesi og tage micrographs af såret med et mikroskop med vedlagte kameraet ved hjælp af en lineal for reference hver anden dag indtil sårene er helede.
8. Histologiske analyse
- aflive mus med en strøm af 2 l/min. af CO 2 i en aktiv dødshjælp kammer efter luminescence falder til under baggrundsniveauerne og sårene er helt helet. Bekræfte død af cervikal dislokation som en anden metode af eutanasi.
- Bruge iris saks til at skabe et bredt, komplet excision omkring og under området såret (ca. 1 cm i diameter) og bevare væv i 4% PARAFORMALDEHYD for histologiske analyse.
- Andre analyse: cytokin opdagelse
- indsamle blod retro-orbitally fra dyr under anæstesi ved hjælp af en kapillær glasrør og overføre det til EDTA-behandlede rør.
- Centrifugeres blod ved 2.000 omdrejninger i 20 min. ved 4 ° C og fryse plasma til registrering af cytokin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I udviklingen af denne nye model, observeret vi mange fordele i at udnytte hairless SKH-1 over C57BL/6J mus, som vi har brugt i fortiden. Dyr underkastes STZ injektioner normalt opleve gradvis vægttab med udbruddet af diabetes; men i sår healing eksperimenter tidligere udført af vores laboratorier gengiver den model, præsenteret af Dunn mfl. (2012) 9 brug af C57BL/6J, drastiske vægttab blev observeret (figur 1). Derimod benytter indeværende Hvornår sår model med SKH-1 mus en statistisk signifikant lavere vægttab blev observeret (P < 0.0001, Mann-Whitney U test). Desuden, ingen dødsfald indtraf i diabetisk SKH-1 mus kohorten inficeret med P. aeruginosa Xen 41 biofilm, mens en 40% dødelighed blev observeret for C57BL/6J inficerede mus i tidligere eksperimenter (figur 2).
En anden fordel til modellen præsenteres her er, at forsøgsmetoden for hår fjernelse trin obligatorisk for C57BL/6J mus er unødvendig for SKH-1 mus. Selv om i vores tidligere eksperimenter med hårede mus fik særlig opmærksomhed at minimere irritation af hud, opstod nogle skader uundgåeligt (figur 3). Navnlig, men er den største fordel i at udnytte hairless mus i denne model afskaffelse af problemet med hår genvækst bemærkede i sigt sårheling undersøgelser. Vores erfaring med C57BL/6J mus, hår genvækst varierede fra dyr til dyr, men givet de langsigtede karakter af undersøgelserne, det altid opstod og blandede sig med sår område målinger eller forvredet sår benskinner og/eller forbindinger bruges til at dække inficeret sår, potentielt resulterer i tørring af såret (figur 4).
I modellen SKH-1 sår healing efter diabetes er bekræftet, kan kirurgi nemt udføres for at oprette en cirkulær fuld-tykkelse sår på bagsiden af dyret. Silikone skinne er holdt på plads af en medicinsk vandtæt hud selvklæbende og undgår direkte kontakt fra okklusiv dressing med nyoprettede sår seng (figur 5).
P. aeruginosa Xen 41 en bioluminescerende biofilm dyrkes på polycarbonat membraner (figur 6) nemt og aseptisk overføres til en sprøjte til at være forberedt til leverance på sår og podede musene overvåges dagligt kliniske tegn på infektion (figur 7). For denne model gennemført vi to særskilte faser. I den første fase, efter podning af biofilm var såret omgivet af en skinne, dækket med en gennemsigtig okklusiv forbinding. Dette resulterer i ophobning af pus, der tilstoppet såret. Biofilm-holdige sår var afbildet dagligt med i vivo imaging system til at overvåge infektion udvikling og vurdere biofilm evolution (figur 8 og figur 9). Bioluminescens, registreret som samlede flux (p/s), kan være korreleret med bakteriel tæthed ved hjælp af en standardkurve (figur 10).
På dag 8, var hejsespil og dressing fjernet for at tillade visualisering af sårheling. Bioluminescens falder efterfølgende på grund af tabet af pus omkring såret; men bakterier forblev forbundet med sår som fastsat af histologi. Denne fremgangsmåde for at fjerne dressing til at måle sårheling er blevet udnyttet i andre kroniske sår healing undersøgelser (REFs). Sårheling progression kan bestemmes ved at tage micrographs med et kamera, der er knyttet til et mikroskop (Figur 11).
Figur 1: sammenlignende procentdel vægttab af SKH-1 og C57BL/6J diabetisk mus. Dag nul svarer til vægten på dag i sidste (5th) STZ injektion. n = 10 mus til SKH-1 og n = 12 mus for C57BL/6J. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: procent overlevelsesrate af SKH-1 og C57BL/6J diabetisk mus efter P. aeruginosa Xen 41 biofilm ansøgning (dag 1). n = 5 mus til SKH-1 og n = 10 mus for C57BL/6J. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hud rifter i fremtiden sårede område efter barbering og brug af depilatory creme på C57BL/6J mus. (A): dag af procedure; (B): 4 dage efter proceduren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: (A) C57BL/6J mus med en delvis fjernet sår skinne. (B) løft af skinne afslørede et helede sår omgivet af fuldt re udvoksede hår. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: kirurgisk procedure for sårede SKH-1 mus. (A) afgrænsning med biopsi punch; (B) skitse af afgrænsningen; (C) sårede afsluttet; (D) anvendelse af medicinsk vandtæt hud lim; (E) limning skinne; (F) sår dækket med okklusiv dressing. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: forberedelse af biofilm inokulum. (A) 72 h koloni biofilm af Pseudomonas aeruginosa Xen 41 dyrkes på polycarbonat membraner; (B) måling af biofilm ved hjælp af en syringe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: SKH-1 Diabetisk mus 6 dage efter sår blev podet med P. aeruginosa Xen 41 biofilm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: overvågning af biofilm infektion ved at spore bioluminescens udviklingen over tid i diabetisk SKH-1 mus. (A) dag af biofilm anvendelse; (B) 5 dage post-biofilm; (C) 8 dage post-biofilm; (D) 12 dage post-biofilm; (E) 16 dage post-biofilm; (F) 20 dage post-biofilm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: samlede flux fra sår i SKH-1 Diabetisk mus inficeret med P. aeruginosa Xen 41 biofilm i løbet af eksperimentet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: anslået CFU pr. sår ved hjælp af en standardkurve for bioluminescens pr. CFU produceret med P. aeruginosa Xen 41 biofilm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Mikrograf tidslinjen af sår inficeret med P. aeruginosa Xen 41 biofilm i diabetisk SKH-1 mus viser progressionen af healing. Dage efter biofilm infektion er angivet i det nederste venstre hjørne af hvert billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en ny musemodel for studier af biofilm i diabetisk kroniske sår, der er mange fordele ved at oprette en reproducerbar, oversætbare og fleksibel model.
Den første nyhed er brugen af hairless mus. Andre musemodeller er blevet udviklet for at studere diabetisk kronisk sårheling10,11, men alle har påberåbt sig anvendelsen af hår mus der kræver fjernelse af pels af processer, der involverer enten voks eller hår klipning kombineret med depilatory cremer. Dette trin er ikke kun tidskrævende og rodet, men skader potentielt huden af dyr i området hvor såret bliver placeret. Mens hairless mus har været brugt i en række carcinogenese undersøgelser12,13, har disse mus ikke blevet brugt til at evaluere biofilm persistens i kroniske sår. Et andet fælles problem løses ved brug af hårløs dyr, især i langsigtede undersøgelser, er hår genvækst i området sår, som kan bringe evaluering af sårheling og forstyrre bandagering.
SKH-1 dyr også vist imødekommenhed over for STZ-induceret Type I diabetes, og i forhold til C57BL/6J mus, havde statistisk signifikant lavere vægttab i løbet af eksperimentet, gør dosering med insulin unødvendige. Dette er en særlig interessant træk, som behandling med insulin kan potentielt påvirke infektion resultaterne som det fremgår af Watters et al. (2014)14 der beskrev en forøgelse af bakterielle tæller i insulin-behandlede diabetisk dyr inficeret med P. aeruginosa biofilm i forhold til ingen insulin modstykker. Derudover i vores model var der en drastisk reduktion i dødelighed i den hårløse kohorte, der angiver, at dyrene er potentielt mere modstandsdygtige i forbindelse med infektion.
En anden funktion i denne model er anvendelsen af målte præformerede biofilm inokulum gylle på inficere sår i modsætning til planktoniske dyrkede celler. Ved at levere en allerede metabolisk komplekse og struktureret bakterielle samfund til såret, de bakterielle celler er i stand til at unddrage sig immun ordningen og de umiddelbare virkninger af biofilm på læsioner kan bestemmes.
Den tredje fordel af denne nye model, sår er brugen af en mikrobiel stamme kan producere bioluminescens, der kan måles med en i vivo imaging system at rumligt lokalisere og kvantificere bakterier. Dette giver mulighed for real-time tracking af biofilm udviklingen over tid. P. aeruginosa Xen 41 stamme besidder en enkelt stabil kopi af P. luminescences luxCDABE operon på bakteriel kromosom, der resulterer i den konstituerende emission af luminescence, som kan opfanges af den ultra-følsomme kamera i billedbehandlingssystem. Denne real-time, ikke-invasiv, i situ -funktionen giver mulighed for måling af biofilm af bioluminescens selv skinne og dækning er på plads. Denne funktion formindsker drastisk antallet af dyr behov pr. undersøgelse, så der er ingen grund til at ofre dyr på visse tidspunkter for biofilm overvågning. Men tilstedeværelsen af biofilm og pus tilstoppet måling sårheling. I denne undersøgelse, vi har fjernet dressing på dag 8 for at tillade visualisering af sårheling, men denne parameter kan ændres afhængigt af de forespørgsler.
Endelig, som imaging systemet er i stand til at opdage bioluminescens op til 2,5 cm i dybden, den nyligt foreslåede model er indstillet til afprøvning af antimikrobielle behandlingsformer i form af løsning eller gel eller indarbejdet til okklusiv forbindinger. En real-time infektion overvågning model giver langt større fleksibilitet til at måle virkningen af forskellige dosering koncentrationer og varigheder i modsætning til en statisk end-point assay. Denne model kan bidrage til validering af potentielle nye behandlinger til at udrydde biofilm i kroniske sår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke den amerikanske Diabetes Association til støtte for dette arbejde (Grant # #7-13-BS-180), Michigan State University forskning teknologi støtte facilitet til uddannelse og adgang til den i vivo imaging system og den Michigan State University undersøgende histopatologi Lab for forarbejdning mus biopsier for histopatologiske undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al.
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
