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Cancer Research

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Abstract

Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des proliferativen Stillstands, der durch biologische Schäden induziert wird, der normalerweise über Jahre in alternden Zellen entsteht, aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden auftreten kann, die durch verschiedene Krebsbehandlungen induziert werden. Die Seneszenz von Tumorzellen wird im Allgemeinen als unerwünscht angesehen, da alternde Zellen gegen den Tod resistent werden und die Tumorremission blockieren, während sie die Tumormalignität und die Behandlungsresistenz verschlimmern. Daher ist die Identifizierung von seneszenten Tumorzellen von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft. Es gibt verschiedene Seneszenzassays, von denen viele auf der Aktivität des bekannten Seneszenzmarkers basieren, der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-Gal).

Typischerweise wird der SA-β-Gal-Assay unter Verwendung eines chromogenen Substrats (X-Gal) an festen Zellen durchgeführt, wobei die langsame und subjektive Zählung von "blauen" alternden Zellen durch Lichtmikroskopie durchgeführt wird. Verbesserte Assays mit zellpermeanten, fluoreszierenden SA-β-Gal-Substraten, einschließlich C12-FDG (grün) und DDAO-Galactosid (DDAOG; weit rot), haben die Analyse lebender Zellen ermöglicht und die Verwendung von Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich Durchflusszytometern, ermöglicht. C12-FDG ist eine gut dokumentierte Sonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit der intrinsischen zellulären Autofluoreszenz (AF), die während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten SA-β-Gal-Sonde DDAOG kann die grünzelluläre Autofluoreszenz als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenz verwendet werden, was die Zuverlässigkeit des Assays erhöht. Die verbleibenden Fluoreszenzkanäle können für die Färbung der Zelllebensfähigkeit oder die optionale fluoreszierende Immunmarkierung verwendet werden.

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und Lipofuszin-Autofluoreszenz als Dual-Parameter-Assay zur Identifizierung von seneszenten Tumorzellen. Es wird eine Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen durchgeführt. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt enthalten sein, um die interessierenden Antigene der Zelloberfläche zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch flusszytometrisch sortiert und für die nachgeschaltete Analyse gesammelt werden. Gesammelte seneszente Zellen können sofort lysiert (z. B. für Immunoassays oder Omics-Analysen) oder weiter kultiviert werden.

Introduction

Seneszente Zellen sammeln sich normalerweise während des normalen biologischen Alterns über Jahre in Organismen an, können sich aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden entwickeln, die durch verschiedene Krebsbehandlungen, einschließlich Bestrahlung und Chemotherapie, verursacht werden. Obwohl sie sich nicht mehr vermehren, können therapieinduzierte seneszente (TIS) Tumorzellen zur Behandlungsresistenz beitragen und ein Rezidiv bewirken 1,2,3. Von TIS-Zellen sezernierte Faktoren können die Tumormalignität verschlimmern, indem sie Immunevasion oder Metastasierung fördern 4,5. TIS-Zellen entwickeln komplexe, kontextspezifische Phänotypen, veränderte Stoffwechselprofile und einzigartige Immunantworten 6,7,8. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung von TIS-Tumorzellen, die durch verschiedene Krebsbehandlungsansätze induziert werden, ein Thema von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft.

Zum Nachweis von TIS-Tumorzellen sind konventionelle Seneszenz-Assays weit verbreitet, die hauptsächlich auf dem Nachweis einer erhöhten Aktivität des Seneszenzmarkerenzyms, der lysosomalen Beta-Galactosidase GLB19, basieren. Der Nachweis bei einem nahezu neutralen (statt sauren) lysosomalen pH-Wert ermöglicht den spezifischen Nachweis von Seneszenz-assoziierter Beta-Galactosidase (SA-β-Gal)10. Ein seit mehreren Jahrzehnten verwendeter Standard-SA-β-Gal-Assay verwendet X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), ein blau-chromogenes Beta-Galactosidase-Substrat, um SA-β-Gal in fixierten Zellen lichtmikroskopischnachzuweisen11. Der X-Gal-Assay ermöglicht die qualitative visuelle Bestätigung von TIS unter Verwendung handelsüblicher Reagenzien und Laborgeräte. Ein einfaches Durchlichtmikroskop ist das einzige Instrument, das erforderlich ist, um das Vorhandensein des blauen Chromogens zu bewerten. Das X-Gal-Färbeverfahren kann jedoch nicht empfindlich sein und manchmal mehr als 24 Stunden dauern, bis sich die Farbe entwickelt. Auf die Färbung folgt eine subjektive Bewertung einzelner seneszenter Zellen mit niedrigem Durchsatz, basierend auf der Zählung der Zellen, die eine gewisse Intensität des blauen Chromogens unter einem Lichtmikroskop aufweisen. Da X-Gal zellundurchlässig ist, erfordert dieser Assay lösungsmittelfixierte Zellen, die für die nachgeschaltete Analyse nicht gewonnen werden können. Bei der Arbeit mit begrenzten Proben von Tieren oder Patienten kann dies ein großer Nachteil sein.

Verbesserte SA-β-Gal-Assays unter Verwendung zellpermeanter, fluoreszierender Enzymsubstrate, einschließlich C 12-FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranosid, grün) und DDAOG (9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on-7-yl) β-D-Galactopyranosid, weit rot) sind bereits in der Literaturerschienen 12,13,14,15. Die chemische Sondenstruktur und die optischen Eigenschaften von DDAOG sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Diese zellpermeierten Sonden ermöglichen die Analyse lebender (und nicht fixierter) Zellen, und fluoreszierende statt chromogene Sonden erleichtern die Verwendung von schnellen Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich High-Content-Screening-Instrumenten und Durchflusszytometern. Sortierdurchflusszytometer ermöglichen die Gewinnung angereicherter Populationen lebender alternder Zellen aus Zellkulturen oder Tumoren für die nachgeschaltete Analyse (z. B. Western Blotting, ELISA oder Omics). Die Fluoreszenzanalyse liefert auch ein quantitatives Signal, das eine genauere Bestimmung des Prozentsatzes der alternden Zellen innerhalb einer bestimmten Probe ermöglicht. Zusätzliche Fluoreszenzsonden, einschließlich Viabilitätssonden und fluorophormarkierter Antikörper, können problemlos für die Multiplexanalyse von Zielen jenseits von SA-β-Gal hinzugefügt werden.

Ähnlich wie DDAOG ist C12-FDG eine Fluoreszenzsonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit intrinsischem zellulärem AF, der während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten in Zellen16 entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten DDAOG-Sonde kann grüner zellulärer AF als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenzverwendet werden 17. Dies verbessert die Assay-Zuverlässigkeit durch die Verwendung eines zweiten Markers zusätzlich zu SA-β-Gal, der oft als einzelner Marker für die Seneszenz18 unzuverlässig sein kann. Da der Nachweis von endogenem Vorhofflimmern in seneszenten Zellen ein markierungsfreier Ansatz ist, ist es eine schnelle und einfache Möglichkeit, die Spezifität unseres DDAOG-basierten Assays zu erweitern.

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und AF als schnellen Dual-Parameter-Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung lebensfähiger TIS-Tumorzellen aus In-vitro-Kulturen oder isoliert aus medikamentös behandelten Tumoren, die in Mäusen etabliert wurden (Abbildung 1). Das Protokoll verwendet Fluorophore, die mit einer Vielzahl von handelsüblichen Durchflusszytometrie-Analysatoren und -Sortierern kompatibel sind (Tabelle 1). Die Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen mittels Standard-Durchflusszytometrie-Analyse ist möglich. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt durchgeführt werden, um die interessierenden Zelloberflächenantigene gleichzeitig mit der Seneszenz zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch mit der Standard-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) angereichert werden.

Figure 1
Abbildung 1: Experimenteller Workflow. Eine schematische Zusammenfassung der wichtigsten Punkte des DDAOG-Assays. (A) Ein TIS-induzierendes Medikament wird Säugetierkulturzellen zugesetzt oder tumortragenden Mäusen verabreicht. Zeit ist dann für den Beginn der TIS vorgesehen: für Zellen, 4 Tage nach der Behandlung; für Mäuse, insgesamt 22 Tage, mit drei Behandlungen alle 5 Tage plus 7 Tage Erholung. Zellen werden geerntet oder Tumore in Suspension dissoziiert. (B) Die Proben werden mit Baf behandelt, um den lysosomalen pH-Wert für den Nachweis von SA-β-Gal für 30 min einzustellen; dann wird eine DDAOG-Sonde für 60 min hinzugefügt, um SA-β-Gal zu erkennen. Die Proben werden 2x in PBS gewaschen und kurz ein Lebensfähigkeitsfleck hinzugefügt (15 min). Optional können Proben in offenen Fluoreszenzkanälen mit fluoreszierenden Antikörpern angefärbt und/oder für eine spätere Analyse fixiert werden. (C) Die Proben werden mit einem Standard-Durchflusszytometer analysiert. Lebensfähige Zellen werden in Punktdiagrammen visualisiert, die rotes DDAOG (was SA-β-Gal anzeigt) versus grüne Autofluoreszenz (Lipofuszin) zeigen. Ein Gate zur Bestimmung des Prozentsatzes der TIS-Zellen wird basierend auf unbehandelten Kontrollproben (nicht gezeigt) erstellt. Wenn ein Sortierzytometer (FACS) verwendet wird, können TIS-Zellen gesammelt und für weitere In-vitro-Assays wieder in Kultur gebracht oder für molekularbiologische Assays lysiert und verarbeitet werden. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; TIS = therapieinduzierte Seneszenz; FL-Ab = fluorophorkonjugierter Antikörper; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Fluorophor Erkennt Ex/Em (nm) Zytometerlaser (nm) Zytometerdetektor / Bandpassfilter (nm)
DDAOG SA-β-Gal 645/6601 640 670 / 30
AF Lipofuszin < 600 488 525 / 50
CV450 Lebensfähigkeit 408/450 405 450 / 50
PE Antikörper/Oberflächenmarker 565/578 561 582 / 15

Tabelle 1: Optische Spezifikationen für Fluorophore und Zytometer. Die in diesem Protokoll verwendeten Zytometerspezifikationen sind für ein Gerät mit insgesamt 4 Lasern und 15 Emissionsdetektoren aufgeführt. DDAOG, das bei 645/660 nm nachgewiesen wird, ist die Form der Sonde, die von SA-β-Gal1 gespalten wurde. Unspaltetes DDAOG kann bei 460/610 nm eine geringe Fluoreszenz aufweisen, wird aber durch Waschschritte im Protokoll entfernt. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; AF = Autofluoreszenz; PE = Phycoerythrin; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase.

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Protocol

Alle beschriebenen Tierarbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Chicago genehmigt.

1. Aufbereitung und Lagerung von Stammlösungen

HINWEIS: Wenn Zellen durchflusssortiert werden, sollten alle Lösungen mit sterilen Techniken vorbereitet und durch eine 0,22-μm-Filtervorrichtung gefiltert werden.

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von DDAO-Galactosid bei 5 mg/ml in DMSO vor. Aliquot bei 50 μL pro Röhrchen (oder gewünschtem Volumen). Bei −20 °C im Dunkeln bis zu 1 Jahr lagern.
  2. Eine Stammlösung von Bafilomycin A1 bei 1 mM in DMSO wird hergestellt. Aliquot bei 50 μL pro Röhrchen (oder gewünschtem Volumen). Bei −20 °C bis zu 6 Monate lagern.
  3. Bereiten Sie eine Stammlösung von Calcein Violet 450 AM bei 1 mM in DMSO vor. Aliquot bei 50 μL pro Röhrchen (oder gewünschtem Volumen). Bei −20 °C im Dunkeln bis zu 1 Jahr lagern.
  4. Zur Behandlung kultivierter Zellen in vitro 10 mM konzentrierte Stammlösungen von Seneszenz-induzierenden Wirkstoffen in dem geeigneten Lösungsmittel herstellen und mit 0,2 μm Spritzenfiltern sterilisieren. Bei −20 °C oder nach Anweisung des Herstellers lagern.
    HINWEIS: Für die Verabreichung von seneszenzinduzierenden Chemotherapeutika in vivo (an Mäuse mit etablierten Tumoren) sollten die Wirkstoffe USP-Grad haben und kurz vor der Injektion aus konzentriertem Bestand zu Kochsalzlösung verdünnt werden.
  5. Bereiten Sie das komplette Kulturmedium für die verwendete(n) Zelllinie(n) vor.
    HINWEIS: Bereiten Sie beispielsweise Medium für B16-F10- oder A549-Zellen mit DMEM 1x + 10% FBS + 1x Glutaminersatz + 1x Penicillin / Streptomycin vor. Medien müssen steril gehalten werden. Andere zelllinienspezifische Medienformulierungen können verwendet werden. Bestimmte Komponenten wie Glutathion können in einigen Fällen den Beginn der Seneszenz stören. Empirische Tests verschiedener Medienformulierungen sollten durchgeführt werden, wenn der Beginn der Seneszenz geringer ist als erwartet oder nicht mit Kontrollchemotherapeutika beobachtet wird.
  6. Bereiten Sie Färbe- und Waschpuffer vor.
    1. Bereiten Sie 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS zur Verwendung bei Färbeverfahren vor. 2 g BSA werden in 200 ml PBS gelöst und 10 min oder bis zur vollständigen Auflösung bei Raumtemperatur gerührt.
    2. 0,5% BSA in 1x PBS als Waschpuffer zubereiten. 100 ml des in Schritt 1.6.1 hergestellten 1%igen BSA werden zu 100 ml 1x PBS für 0,5% BSA verdünnt.
    3. Puffer bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.
  7. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd in 1x PBS vor. Verwenden Sie handelsübliche, versiegelte Paraformaldehydampullen (z. B. 16% v / v) für Komfort und Stabilität: 2,5 ml 16% PFA + 7,5 ml 1x PBS (= 10 mL 4% PFA). Passen Sie das vorbereitete Volumen in Abhängigkeit vom Gesamtvolumen an, das pro Experiment benötigt wird.
    HINWEIS: Bereiten Sie sich nach Bedarf nur auf die Zellfixierung vor; Jedes Mal frisch zubereiten.
  8. FACS-Sortierpuffer vorbereiten: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Sterilfiltrieren durch eine 0,22 μm Filtervorrichtung und bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
    HINWEIS: Bereiten Sie sich nach Bedarf nur für die FACS-Sortierung vor. Die Formulierungen der Durchflusssortierpuffer können je nach FACS-Instrument variieren. Die obige Formulierung ist kompatibel mit dem in dieser Studie verwendeten Instrument (siehe Materialtabelle). Konsultieren Sie die Richtlinien des Herstellers.
  9. Tumordissoziationslösung vorbereiten: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/ml DNAse I in RPMI-1640-Medien (ohne FBS oder andere Ergänzungen). Stammlösungen sind nützlich, um Liberase TL (hergestellt und gelagert nach Anweisung des Herstellers) und DNAse I (100 mg/ml in doppelt destilliertem Wasser [ddH2O], gelagert bei −20 °C) bereitzuhalten.
    HINWEIS: Bereiten Sie sich nach Bedarf vor, wenn Sie nur Tumore verwenden; Jedes Mal frisch zubereiten.

2. Induktion der Seneszenz durch Chemotherapeutika in kultivierten Krebszellen

HINWEIS: Alle Schritte zur Zellmanipulation in diesem Abschnitt sollten in einer Biosicherheitswerkbank mit sterilen Praktiken durchgeführt werden. Dieser Abschnitt ist für adhärente Zelltypen geschrieben. Suspensionszellen können mit geeigneten Modifikationen wie angegeben verwendet werden.

  1. Züchten Sie Krebszelllinien gemäß dem Standardprotokoll des Lieferanten oder des Labors, das die spezifische(n) Zelllinie(n) zur Verfügung gestellt hat.
    HINWEIS: Zellen mit niedriger Passage (p < 10) werden im Allgemeinen bevorzugt, da es in unbehandelten Zellproben zu einem geringeren Grad an replikativer Seneszenz, d.h. niedrigerem Hintergrund, kommt.
  2. Einen Tag vor der Seneszenzinduktion durch Medikamente entpacken Sie Zellen mit Trypsin-EDTA 0,25% (oder wie empfohlen). Trypsin wird durch Zugabe eines gleichen Volumens des vollständigen Kulturmediums neutralisiert und die Zellsuspension in ein steriles konisches Röhrchen überführt.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist für Suspensionszellen nicht erforderlich.
  3. Zählen Sie die Zellen mit der Standard-Hämazytometermethode und erfassen Sie Zellen / ml. Plattenzellen bei 1 × 10 3-10 × 103 Zellen/cm2 in Standard-6-Well-Kunststoffkulturschalen.
    HINWEIS: Die optimale Beschichtungsdichte hängt von der Proliferationsrate der Zellen ab und sollte vom Benutzer bestimmt werden. Die Zellen sollten sich zum Zeitpunkt der Behandlung (d.h. nach 18-24 h Inkubation nach der Beschichtung) in einem logarithmischen Phasenwachstum bei etwa 10%-20% Konfluenz befinden. Die Ausgangsdichte (Zellen/ml) von Suspensionszellen sollte vom Benutzer bestimmt werden. Sechs-Well-Platten liefern typischerweise genügend seneszente Zellen pro Vertiefung für eine Standard-Durchflusszytometrie-Analyseprobe. Bei der Durchflusssortierung sollte eine viel größere Oberfläche (z. B. mehrere P150-Platten) verwendet werden, um die Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von seneszenten Zellen für nachgeschaltete Assays zu ermöglichen (≥1 × 106).
  4. Inkubieren Sie die plattierten Zellen über Nacht (18-24 h) in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2 und einer Feuchtepfanne.
  5. Behandeln Sie die plattierten Zellen mit Seneszenz-induzierenden Chemotherapeutika. Fügen Sie mindestens eine Positivkontrolle hinzu, z. B. Etoposid (ETO) oder Bleomycin (BLM). Bereiten Sie doppelte Brunnen pro Medikament vor. Fügen Sie einen Satz bei, der nur mit Fahrzeugsteuerung behandelt wird.
    HINWEIS: Eine Dosiskurve für jedes experimentelle Mittel sollte vom Anwender getestet werden, um die optimale Konzentration für die Seneszenzinduktion in der (den) verwendeten Zelllinie(n) zu bestimmen.
  6. Inkubieren Sie die Zellen für 4 Tage in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2 und einer Feuchtigkeitspfanne, um den Beginn der Seneszenz zu ermöglichen. Untersuchen Sie täglich mit einem Lichtmikroskop auf erwartete Veränderungen der Morphologie.
    HINWEIS: Inkubationszeiten von 3-5 Tagen können abhängig von der Rate des Seneszenzbeginns akzeptabel sein. Medien können gewechselt und das Mittel nach Wunsch erneut aufgetragen werden (oder nicht), um gesunde Wachstumsbedingungen zu fördern und gleichzeitig einen akzeptablen Prozentsatz an alternden Zellen zu erreichen.
  7. Nach Beginn der Seneszenz ernten Sie die Zellen durch Zugabe von Trypsin-EDTA 0,25% für 5 min bei 37 °C. Wenn Zellen in Suspension dissoziiert werden, neutralisieren Sie Trypsin mit einem gleichen Volumen des vollständigen Mediums.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn Zellen in Suspension wachsen. Wenn eine Oberflächenmarkerfärbung durchgeführt wird, vermeiden Sie die Verwendung von Trypsin-EDTA, da es Oberflächenantigene auf Zellen vorübergehend zerstören kann. Dissoziieren Sie die Monoschicht stattdessen vorsichtig mit einem sterilen Kunststoffzellschaber (oder einem alternativen Dissoziationsreagenz zur Erhaltung von Oberflächenantigenen).
  8. Zählen Sie die Zellen in jeder Probe mit einem Hämazytometer. Berechnen Sie die Zellen/ml für jede Probe.
    HINWEIS: Trypanblau kann hinzugefügt werden, um den Prozentsatz toter Zellen an dieser Stelle zu bewerten (dh aufgrund einer medikamentösen Behandlung), aber der Zelltod wird auch mit einem fluoreszierenden Lebensfähigkeitsfarbstoff während des DDAOG-Färbe-Workflows bestimmt.
  9. Aliquot ≥0,5 × 106 Zellen pro Probe in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen pro Probe sollte über alle Proben standardisiert werden.
  10. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.000 × g in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
    HINWEIS: Wenn keine gekühlte Mikrozentrifuge verfügbar ist, kann es akzeptabel sein, Zentrifugationen bei Umgebungstemperatur für bestimmte elastische Zelltypen durchzuführen.
  11. Fahren Sie mit DDAOG-Färbung in Abschnitt 4 fort.

3. Induktion der Seneszenz durch Chemotherapeutika in Tumoren, die bei Mäusen etabliert wurden

HINWEIS: Wenn Tumorzellen FACS-sortiert werden, stellen Sie die Sterilität bei jedem Schritt sicher, indem Sie in einer Biosicherheitswerkbank arbeiten und mit sterilen Instrumenten, Verfahren und Reagenzien arbeiten.

  1. Erstellen Sie Maustumormodelle durch subkutane Injektion von Krebszellen nach Standardmethoden (z. B. Appelbe et al.19).
    HINWEIS: Die Anzahl der zu injizierenden Krebszellen, die Injektionsstelle und der entsprechende Mausstamm sollten für jedes Protokoll optimiert werden. Hier wurden B16-F10-Zellen subkutan bei 1 × 106 Zellen in 0,1 ml Kochsalzlösung (1 × 107 Zellen/ml) injiziert.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit von Zellen, die Trypanblau verwenden, >90% beträgt, bevor Sie Injektionen durchführen. Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran.
    2. Betäuben Sie 6-7 Wochen alte weibliche C57/BL6-Mäuse mit einer Mischung aus 3% Isofluran und Luft und halten Sie sie unter diesen Bedingungen in einer Induktionskammer in einer sterilen Biosicherheitswerkbank. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie den Fuß der Maus sanft kneifen. Tragen Sie sterile Veterinärsalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern. Halten Sie während des Eingriffs die Körpertemperatur der Maus mit einer Heizlampe aufrecht.
    3. Entfernen Sie die Maus in einer sterilen Biosicherheitswerkbank aus der Induktionskammer und bringen Sie sie in Kontakt mit einem Nasenkegel, der eine Isofluranversorgung von 3% bietet. Rasieren Sie den Flankenbereich an der Injektionsstelle mit einem sauberen Elektrorasierer. Mischen Sie die vorbereitete Zellsuspension kurz, indem Sie das Röhrchen kurz vor der Injektion manuell umdrehen, und injizieren Sie die Zellsuspension subkutan in die rasierte Flanke(n) mit einer sterilen 0,5-ml-Spritze, die mit einer sterilen 27-G-Nadel ausgestattet ist. Nehmen Sie die Maus aus der Haube und bringen Sie sie in den Auffangkäfig.
    4. Überwachen Sie im Erholungskäfig kontinuierlich die Vitalfunktionen der Mäuse, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten, den aufrichtenden Reflex demonstrieren und sich sicher im Käfig bewegen können. Lassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt und geben Sie Tiere, die einer Tumorzellimpfung unterzogen wurden, nicht in Begleitung anderer Tiere zurück, bis sie vollständig genesen sind. Überwachen Sie alle geimpften Mäuse täglich auf Gewichtsverlust, verminderte Aktivität / Mobilität und neurologische Symptome; Euthanasieren Sie Mäuse, die schwere Symptome in jeder Kategorie zeigen. Bei Mäusen, die nach der Impfung Schmerzsymptome zeigen, einmal subkutan Buprenorphin (0,1-0,2 mg/kg) verabreichen.
      HINWEIS: Mäuse, die nach Buprenorphin anhaltende Schmerzen zeigen, sollten eingeschläfert werden.
  2. Beginnen Sie 5-7 Tage nach der Krebszellimpfung, messen Sie das Tumorwachstum mit Messschiebern alle 2-3 Tage. Beginnen Sie mit der Proseneszenzbehandlung, wenn der Tumor ein Volumen von 50 mm 3 ± 10 mm3 erreicht hat.
    HINWEIS: In dieser Arbeit wurden Dosen von Doxorubicinhydrochlorid (DOX) oder PEGyliertem liposomalem Doxorubicin (PLD) in 10 mg/kg in 0,9% Natriumchlorid-Injektion (USP) verabreicht. Medikamente wurden intraperitoneal 3x, einmal alle 5 Tage, injiziert, beginnend mit Tumoren erreichten 50 mm 3 ± 10 mm3. Mäuse erholten sich für 7 Tage nach der letzten Behandlung, um das Auftreten von TIS in Tumoren zu ermöglichen. Seneszenzinduktionsdosierungen und -bedingungen für andere Behandlungen und/oder Tumormodelle sollten optimiert werden.
  3. 7 Tage nach der abschließenden medikamentösen Behandlung opfern Sie die Mäuse durch CO2 -Überdosierung und Zervixluxation oder andere zugelassene Methoden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Arbeit von Labortieren. Entfernen Sie die Tumore und sammeln Sie sie in sterilen Röhrchen oder 6-Well-Platten, die mit sterilem RPMI-Wachstumsmedium gefüllt sind (um die Lebensfähigkeit während der Verarbeitung zu erhalten).
    HINWEIS: Bei einer histologischen Untersuchung (z. B. X-Gal oder Immunhistochemie) können Tumore hier halbiert werden, wobei eine Hälfte in O.C.T.-Einbettungsmedium eingefroren und mit Standardverfahren für die Frozen Tissue Histology kryosektioniert wird. Die verbleibende Tumorhälfte sollte reichlich Material für Dissoziation und DDAOG-Färbung liefern.
  4. Übertragen Sie einen Tumor in eine P100-Plastikschale, die 5 ml RPMI-Medium enthält. Zerkleinern Sie den Tumor mit einem Skalpell.
  5. 5 ml der Suspension von Tumorstücken, die suspendierte Zellen und Trümmer enthalten, in ein 15 ml konisches Röhrchen überführen. Verwenden Sie die breitere Spitze einer 25-ml-serologischen Pipette zum Übertragen dieser Suspension, wenn große Ablagerungen vorhanden sind. Spülen Sie die Schale mit einem zusätzlichen Volumen sterilen RPMI ab, um Materialien zu sammeln. Verschließen und das konische Rohr auf Eis legen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3.45-3.5 für die verbleibenden Tumoren. Verwenden Sie eine separate Platte und ein Skalpell für jeden Tumor, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, oder spülen Sie gut mit PBS zwischen den Tumoren. Verwenden Sie 5 ml frisches Medium, um jeden Tumor zu zerkleinern.
  7. Bereiten Sie die Tumordissoziationslösung vor: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/ml DNAse I in RPMI-1640-Medien (ohne FBS).
    HINWEIS: Es gibt viele wirksame Formulierungen für Tumordissoziationslösungen, die eine Vielzahl von Enzymen und anderen Komponenten verschiedener Hersteller enthalten können. Optimale Konzentrationen von Komponenten können je nach Tumorart stark variieren. Wenn rote Blutkörperchen im Tumor stark vorhanden sind, kann zusätzlich eine Erythrozytenlyse durchgeführt werden; Wenn tote Zellen ein Problem darstellen, kann ein Kit zum Entfernen toter Zellen verwendet werden. Es wird dem Benutzer dringend empfohlen, unabhängig optimale Tumordissoziationsbedingungen zu bestimmen, die eine hohe Lebensfähigkeit und geringe Präsenz von kontaminierenden Zellen, Bindematerial und Trümmern bieten.
  8. Zentrifugieren Sie alle Tumorproben in konischen Röhrchen für 5 min bei 1.000 × g (4 °C). Entfernen Sie den Überstand.
  9. Fügen Sie jeder Tumorprobe 1-5 ml Tumordissoziationslösung hinzu, abhängig vom Volumen des Tumormaterials. Stellen Sie sicher, dass sich 1-2 ml mehr als das Tumormaterialpellet in der Röhre befinden. Wirbeln Sie mit mäßiger Geschwindigkeit zum Mischen.
  10. Legen Sie die Proben in einen 37 °C Inkubator mit schneller Rotation für 45 min. Wirbel kurz alle 15 min.
  11. Filtern Sie jede Probe durch ein 100-μm-Zellsieb in ein 50-ml-konisches Röhrchen. Wenn die Proben zu viskos sind, um den Filter zu passieren, fügen Sie 10 ml RPMI-1640-Medium hinzu, um sie zu verdünnen. Spülen Sie die Filter mit RPMI-Medium ab, um die Restzellen zu sammeln.
  12. Verwenden Sie ein Hämazytometer, um die Zellen / ml für jede Probe zu zählen.
  13. Aliquot zwei oder mehr Replikate von 5 × 106 Zellen pro Tumorprobe.
  14. 5 min bei 1.000 × g (4 °C) zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
  15. (Optional) Kryokonservierung der Tumorproben für eine spätere DDAOG-Färbung, falls gewünscht.
    1. Resuspendieren Sie das dissoziierte Tumorzellpellet in Kryokonservierungsmedium: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, hergestellt unter sterilen Bedingungen bei 5 × 106 Zellen/ml.
    2. Aliquot 1 ml Zellsuspension in jedes Kryovial.
    3. Die Kryoviale werden 24 h lang in einem Gefrierbehälter für Isopropanolzellen bei −80 °C eingefroren. Dann zur längerfristigen Lagerung (>1 Woche) in die Kryolagerung mit flüssigem Stickstoff überführen.
    4. Wenn eine Färbung gewünscht wird, tauen Sie die Kryoviale auf Eis auf und fahren Sie mit der DDAOG-Färbung in Abschnitt 4 fort.
      HINWEIS: Einige Tumoren bleiben durch Kryokonservierung möglicherweise nicht lebensfähig, und die Widerstandsfähigkeit gegenüber diesem Prozess sollte vom Benutzer für das interessierende Tumormodell bewertet werden.
  16. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die DDAOG-Färbung fort.

4. DDAOG-Färbung von SA-β-Gal in Zell- oder Tumorproben

  1. 1 mM Bafilomycin A1-Schaft bei 1:1.000x in DMEM-Medium (ohne FBS) für eine Endkonzentration von 1 μM verdünnen.
  2. Vorbereitete Baf-DMEM-Lösung zu den Zellpelletproben (aus Schritt 2.11 oder Schritt 3.16) für eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml geben.
    HINWEIS: Wenn Sie beispielsweise 0,5 × 106 Zellen pro Probe verwenden, fügen Sie 0,5 ml Baf-DMEM hinzu. Bei Tumoren können 5 × 106 Zellen in 5 ml Baf-DMEM gefärbt werden.
  3. Inkubieren Sie 30 min bei 37 °C (ohne CO2) auf einem Rotator/Shaker mit langsamer Geschwindigkeit.
    HINWEIS: Vermeiden Sie CO2-Inkubatoren für den Färbeprozess, die Lösungen ansäuern und dadurch die Baf- und DDAOG-Färbung stören können.
  4. Geben Sie ohne Waschen die DDAOG-Stammlösung (5 mg/ml) 1:500x (10 μg/ml endgültig) zu jeder Probe. Pipette zum Mischen. Rotator/Shaker bei 37 °C (ohne CO2) 60 min ersetzen. Vor direktem Licht schützen.
  5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.000 x g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
  6. Mit 1 ml eiskaltem 0,5% BSA pro Röhrchen und Pipette zum Mischen waschen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.000 x g bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um die Zellen gründlich zu waschen. Entfernen Sie den Überstand und fahren Sie fort.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Waschschritte in Schritt 4.6 durchzuführen, um ungespaltenes DDAOG zu entfernen, das eine unerwünschte Fluoreszenzemission (460/610 nm) aufweisen kann.
    HINWEIS: Wenn Sie eine Immunfärbung für Zelloberflächenmarker durchführen, fahren Sie mit Abschnitt 5 unten fort.
  7. (Optional) Fixierung und Lagerung von DDAOG gefärbten Zellen zur späteren Analyse
    1. 0,5 ml eiskaltes 4% Paraformaldehyd tropfenweise zu jeder gewaschenen Probe geben. Pipette zum Mischen.
    2. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 ml PBS.
    4. Lagern Sie die Proben vor der Durchflusszytometrie-Analyse bis zu 1 Woche bei 4 °C.
      HINWEIS: Überspringen Sie bei korrigierten Stichproben Schritt 4.8.
  8. Verdünnen Sie Calcein Violet 450 AM Stock (1 mM) bei 1:1.000x in 1% BSA-PBS (1 μM final). Geben Sie 300 μL (für kultivierte Zellproben) oder 1.000 μL (für Tumorproben) zu den gewaschenen Zellpellets aus Schritt 4.6. 15 min auf Eis im Dunkeln ausbrüten.
  9. Fahren Sie mit der Einrichtung der Durchflusszytometrie fort (Abschnitt 6).

5. (Optional) Immunfärbung für Zelloberflächenmarker in Kombination mit DDAOG

HINWEIS: Wie bei jedem Durchflusszytometrie-Experiment sollten einfach gefärbte Kontrollproben nur mit DDAOG und nur fluoreszierenden Antikörpern vorbereitet werden, um Übersprechen (falls vorhanden) über Fluoreszenzkanäle zu bestimmen. Wenn ein Übersprechen beobachtet wird, sollte eine Standard-Durchflusszytometrie-Kompensation durchgeführt werden20.

  1. Resuspendieren Sie die in Schritt 4.6 erhaltenen Zellpellets in 100 μL Färbepuffer (1% BSA in 1x PBS).
  2. Fügen Sie das für die Zellspezies (Maus oder Mensch) geeignete Fc-Rezeptor-blockierende Reagenz bei der vom Hersteller empfohlenen Titration hinzu. 10 min bei 24 °C inkubieren.
  3. Fügen Sie fluorophorkonjugierte Antikörper bei der vom Hersteller empfohlenen (oder vom Benutzer bestimmten) Titration hinzu. 20 min auf Eis, vor Licht geschützt, inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 1.000 × g bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
  5. Mit 1 mL eiskaltem Waschpuffer (0,5% BSA-PBS) pro Röhrchen und Pipette zum Mischen waschen. Die Röhrchen 5 min bei 1.000 × g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um die Zellen gründlich zu waschen.
  6. 1 mM Calcein Violet 450 AM bei 1:1.000x zu 1% BSA-PBS verdünnen. Geben Sie 300 μL zu den gewaschenen Zellpellets aus Schritt 5.5. 15 min auf Eis im Dunkeln ausbrüten.
  7. Fahren Sie mit der Durchflusszytometrie-Analyse fort (Abschnitte 6-7).

6. Einrichtung und Datenerfassung des Durchflusszytometers

  1. Die Zellproben werden in Röhrchen überführt, die mit dem Durchflusszytometriegerät kompatibel sind. Stellen Sie die Schläuche auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.
    HINWEIS: Wenn Aggregate in den Zellsuspensionen beobachtet werden, passieren Sie die Suspension vor der Analyse durch 70-100 μm Zellsiebe. Verwenden Sie keine 40-μm-Siebe, da diese einige der größeren alternden Zellen ausschließen können.
  2. Öffnen Sie in der referenzierten Software (siehe Materialtabelle) die folgenden Diagramme: 1) FSC-A vs SSC-A Punktdiagramm, 2) Violettkanalhistogramm, 3) Fernrotkanal (z. B. APC-A) versus Grünkanal (z. B. FITC-A) Punktdiagramm.
    HINWEIS: Doublet-Ausschlussdiagramme und Einkanalhistogramme können ebenfalls verwendet werden, sind aber nicht unbedingt erforderlich.
  3. Initiieren Sie die Zytometer-Datenerfassung.
    1. Legen Sie die mit DDAOG angefärbte Fahrzeugkontrollprobe auf die Ansaugöffnung. Beginnen Sie bei einer niedrigen Aufnahmegeschwindigkeit mit der Erfassung von Probendaten.
    2. Passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen so an, dass >90 % der Ereignisse im Diagramm enthalten sind. Wenn Zellen nicht gut in das Diagramm passen, verringern Sie die Einstellung für die Flächenskalierung auf 0,33-0,5 Einheiten.
    3. Entfernen Sie die reine Fahrzeugprobe, ohne Daten aufzuzeichnen.
    4. (Optional) Fügen Sie einen Tropfen Regenbogenkalibrierungsmikrosphären in ein Zytometerröhrchen mit 1 ml PBS hinzu. Setzen Sie das Röhrchen auf die Zytometer-Ansaugöffnung. Beginnen Sie mit der Erfassung von Beispieldaten.
    5. Stellen Sie die violetten, grünen und tiefroten Kanalspannungen so ein, dass der oberste Peak der Regenbogenmikrosphäre im Bereich von 104-10 5 Einheiten relativer Fluoreszenz in jedem Kanal liegt und alle Peaks in jedem Kanal gut getrennt sind. Rekord von 10.000 Ereignissen. Entfernen Sie den Schlauch.
  4. Legen Sie die mit DDAOG angefärbte Positivkontrollprobe (z. B. BLM, ETO) auf die Ansaugöffnung. Erfassen Sie bei niedriger Geschwindigkeit Beispieldaten. Beobachten Sie die Ereignisse in FSC-, SSC-, violetten, grünen und tiefroten Kanälen, um sicherzustellen, dass über 90% der Ereignisse in allen Diagrammen enthalten sind. Achten Sie auf eine Erhöhung des AF- und DDAOG-Signals im Vergleich zur reinen Fahrzeugsteuerung.
  5. Wenn Sie ein Sortierzytometer verwenden, starten Sie die Sortierung in diesem Schritt.
    1. Zeichnen Sie zu Aufzeichnungszwecken 10.000 Zellen für die Kontrollprobe und jede sortierte Probe auf.
    2. Sortieren Sie die gewünschte Menge an Zellen (≥1 × 106 ist typischerweise geeignet) in ein gerätegeeignetes Sammelröhrchen mit 3-5 ml Kulturmedium.
    3. Fahren Sie nach dem Sortieren mit der nachgelagerten Kultur oder Analyse fort.
    4. Fahren Sie mit Abschnitt 7 für die Routineanalyse sortierter Proben fort.
  6. Wenn Sie fluoreszierende Antikörper verwenden, optimieren Sie hier die Kanalspannungen mit den in Abschnitt 5 vorbereiteten ungefärbten, einfach gefärbten und doppelt gefärbten Proben.
    HINWEIS: Für das hier verwendete kalibrierte Durchflusszytometer lagen die optimalen Kanalspannungen typischerweise zwischen 250 und 600 (mittlerer Bereich), aber die optimalen Spannungen und Kanalspannungsbereiche variieren je nach Gerät. Vermeiden Sie die Verwendung von Spannungen in sehr niedrigen oder hohen Bereichen, die Signale unterdrücken oder Rauschen verstärken können.
  7. Nachdem Sie die Schritte 6.1-6.5 abgeschlossen und die Zytometereinstellungen bei Bedarf angepasst haben, zeichnen Sie die Daten für alle Proben auf. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen für alle Probenaufnahmen einheitlich bleiben. Aufzeichnung von ≥10.000 Ereignissen pro kultivierter Zellprobe oder ≥100.000 Ereignissen pro Tumorzellprobe.
    HINWEIS: Obwohl Gating und Analyse mit Datenerfassungssoftware (z. B. FACSDiva) durchgeführt werden können, wird in Abschnitt 7 unten ein vollständiger Gating- und Analyse-Workflow beschrieben, der nach der Erfassung mit separater Analysesoftware (FlowJo) durchgeführt wird. Die Analyse nach der Erfassung wird bevorzugt, um die Zeit am Zytometer-Arbeitsplatz zu reduzieren und zusätzliche Tools zu nutzen, die in der dedizierten Analysesoftware enthalten sind.
  8. Speichern Sie Beispieldaten im FCS-Dateiformat. Exportieren Sie die Dateien auf einen Arbeitsplatzrechner, der mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware (z. B. FlowJo) ausgestattet ist. Fahren Sie mit Abschnitt 7 fort.

7. Datenanalyse der Durchflusszytometrie

HINWEIS: Der vorgestellte Workflow verwendet die FlowJo-Software. Alternative Durchflusszytometrie-Datenanalysesoftware kann verwendet werden, wenn die in diesem Abschnitt beschriebenen Schlüsselschritte in ähnlicher Weise befolgt werden.

  1. Öffnen Sie mit der FlowJo-Software .fcs-Datendateien aus Schritt 6.7.
  2. Öffnen Sie das Layoutfenster.
  3. Ziehen Sie alle Beispiele per Drag & Drop in das Layoutfenster.
  4. Gate lebensfähige Zellen.
    1. Doppelklicken Sie zunächst auf die Beispieldaten für das reine Fahrzeugsteuerelement, um dessen Datenfenster zu öffnen.
    2. Visualisieren Sie die Daten als Violettkanalhistogramm. Identifizieren Sie die lebensfähigen Zellen, die mit CV450 gefärbt wurden, basierend auf ihrer helleren Fluoreszenz als die toten Zellen.
    3. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Einzelgatter-Histogramm-Werkzeug, um nur lebensfähige Zellen einzubeziehen. Nennen Sie das Tor lebensfähig.
    4. Ziehen Sie dann aus dem Probenlayoutfenster das funktionsfähige Gate auf die anderen Zellproben, um das Gate gleichmäßig anzuwenden.
    5. Visualisieren Sie im Layoutfenster alle Proben als Violettkanalhistogramme (Lebensfähigkeit). Stellen Sie sicher, dass lebensfähiges Zellgating für alle Proben geeignet ist, bevor Sie fortfahren. Wenn nicht, nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor.
      HINWEIS: Die Viabilitätsfärbung kann Unterschiede zwischen Behandlungen oder Tumoren aufweisen.
  5. Gate alternde Zellen.
    1. Doppelklicken Sie auf die Gated Viable Cell-Daten für die reine Fahrzeugsteuerung, um ihr Datenfenster zu öffnen.
    2. Visualisieren Sie die Daten als Punktdiagramm für den Fernroten Kanal (DDAOG) im Vergleich zum Grünkanal (AF).
    3. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Rechteck-Gating-Tool, um <

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Representative Results

Mehrere Experimente wurden durchgeführt, um die Vergleichbarkeit von DDAOG mit X-Gal und C12-FDG für den Nachweis der Seneszenz durch SA-β-Gal zu demonstrieren. Zunächst wurde X-Gal verwendet, um seneszente B16-F10-Melanomzellen zu färben, die durch ETO induziert wurden (Abbildung 2A). Eine intensive blaue Farbe entwickelte sich in einer Untergruppe von ETO-behandelten Zellen, während andere Zellen eine weniger intensive blaue Färbung aufwiesen. Die Morphologie war in den meisten ETO-behandelten Zellen vergrößert. Die Färbung von ETO-behandelten Zellen mit fluoreszierendem SA-β-Gal-Substrat C12-FDG (grün) oder DDAOG (weit rot) zeigte vergleichbare Färbemuster und Intensitätsvariationen wie X-Gal (Abbildung 2B). Die grüneC12-FDG-Emission überlappte sich jedoch mit zellulärem Vorhofflimmern (Abbildung 2C), von dem bekannt ist, dass es sich in seneszenten Zellenansammelt 17. Im Gegensatz dazu war der AF im tiefroten Emissionsbereich von DDAOG vernachlässigbar.

Anstatt ein Fluoreszenzmikroskop zu verwenden, um alternde Zellen zu bewerten und zu zählen, war es sinnvoller, die Hochdurchsatzfähigkeiten eines Durchflusszytometers zu nutzen, um Daten für Tausende von Zellen pro Probe in kurzer Zeit (<5 Minuten pro Probe) zu erfassen. Zunächst wurde eine Reihe von Standard-Durchflusszytometrie-Setup-Parametern implementiert, um eine optimale Datenerfassung zu gewährleisten (Abbildung 3). Nach einem typischen Ansatz wurden Lichtstreuparameter eingestellt, um das Volumen (Vorwärtsstreuung, FSC) und die Granularität (Seitenstreuung, SSC) von Zellen zu visualisieren (Abbildung 3A). Hier stellten wir den Trend eines erhöhten Volumens von ETO-behandelten Zellen fest, was mit der vergrößerten Morphologie übereinstimmte, die typischerweise für seneszente Zellen mittels Mikroskopie beobachtet wird. Eine Reduzierung der Standardeinstellungen für die Flächenskalierung (auf 0,33-0,50 Einheiten je nach Zelltyp und Behandlung) war notwendig, um mehr der größeren Zellen auf dem Diagramm zu visualisieren. Bei einigen Zelllinien/Behandlungen zeigte sich auch eine erhöhte Granularität (SSC) (Daten nicht gezeigt). Insgesamt wurde die Streuauswertung als Qualitätskontrollschritt verwendet, um zu überprüfen, ob die Zellstreudaten wie erwartet erschienen, keine übermäßigen Zelltrümmer vorhanden waren und die Zellen mit geeigneten Flussraten (~ 100-1000 Zellen / s) durch das Zytometer verarbeitet wurden. Als Qualitätskontrollschritt, der nur für die Geräteeinrichtung verwendet wird, wurde hier keine Ansteuerung oder Analyse durchgeführt.

Ein zweiter (optionaler) Schritt im Aufbau der Durchflusszytometrie bestand darin, eine Probe kommerziell erhältlicher "Regenbogen"-Kalibrierungspartikel kurz zu analysieren, um sicherzustellen, dass die fluoreszierenden Detektionsspannungen in akzeptablen Bereichen eingestellt wurden (Abbildung 3B). Der hellste Peak wurde zwischen 1 × 104 Einheiten und 1 × 105 Einheiten relativer Fluoreszenzintensität in jedem Kanal eingestellt, mit klar definierten Peaks niedrigerer Intensität, ausreichender Trennung zwischen den einzelnen Peaks und keiner Überlappung benachbarter Peaks. Mit diesen Spannungseinstellungen wurde eine Kontrollprobe von 10.000 Mikrokugeln aufgenommen. Die Mikrosphären wurden dann auf diese Weise in jeder Zytometriesitzung verwendet, um die Einheitlichkeit der Datenerfassung im Verlauf des Protokolls zu verbessern.

Als nächstes wurden Proben von nur Vehikel- oder ETO-behandelten Zellen in jedem fluoreszierenden Kanal sichtbar gemacht und Gates gesetzt. Die Zelllebensfähigkeitstore wurden basierend auf dem Signal der CV450-Viabilitätsfärbung im violetten Kanal festgelegt (Abbildung 3C). Nur mit Vehikel behandelte Zellen zeigten eine Lebensfähigkeit von 88% und ETO-behandelte Zellen eine Lebensfähigkeit von 75% (in der endgültigen Zellprobe; zusätzliche tote Zellen wurden wahrscheinlich zunächst in verworfenen Kulturmedien entfernt und während des Färbeprozesses mechanisch zerfallen). Als nächstes wurden lebensfähige Gated Zellen in den grünen (Abbildung 3D) und fernroten (Abbildung 3E) Emissionskanälen visualisiert. Die Gatter für grüne AF HI und tiefrote DDAOGHI wurden auf <5% der reinen Fahrzeugzellen festgelegt, und diese Gatter wurden dann auf ETO-behandelte Zellen angewendet. Mit diesem Ansatz wurde festgestellt, dass 46% der ETO-behandelten Zellen AF HI und 33% DDAOGHI waren; Diese Werte lagen im erwarteten Bereich, basierend auf der Literatur und den Ergebnissen zahlreicher Wiederholungsexperimente in unserem Labor. Sobald das Zytometer-Setup abgeschlossen war, wurden alle Zellproben im Experiment mit identischen Datenerfassungseinstellungen durchgeführt. Es wurden Daten für 10.000 Ereignisse pro Stichprobe erhalten.

Repräsentative Assay-Daten sind in Abbildung 4 dargestellt. B16-F10 murine Melanomzellen oder A549 menschliche Lungenadenokarzinomzellen wurden als Krebszelllinienmodelle verwendet. Jede Zelllinie wurde 4 Tage lang mit einem Chemotherapeutikum behandelt, von dem bekannt ist, dass es Seneszenz (ETO oder BLM) induziert, um eine Seneszenz oder nur Vehikel zu induzieren. Weiterhin wurde das bekannte senolytische Mittel ABT-26321 für 2 Tage zu induzierten seneszenten Zellen zugesetzt, um die Spezifität der DDAOG-Sonde zu demonstrieren. Als zusätzliche Kontrollen wurden nur ABT-263-Proben hergestellt. Hier werden die Daten als 2D-Punktdiagramme mit DDAOG (670 nm Emission) versus AF (525 nm) visualisiert. Der Workflow aus Abbildung 3 wurde für die Einrichtung des Zytometers verwendet, und ein TIS-Gate wurde so eingestellt, dass <5% der reinen Fahrzeugzellen als TIS bewertet wurden. Die Ergebnisse mit B16-F10-Zellen (Abbildung 4A) zeigten, dass ETO TIS in 35% der lebensfähigen B16-F10-Zellen induzierte (ähnlich den vergleichbaren Daten in Abbildung 2D,E) und das senolytische Mittel TIS-Zellen fast vollständig eliminierte (<2%). In A549-Zellen (Abbildung 4B) induzierte BLM TIS in 66% der lebensfähigen Zellen und ABT-263 reduzierte den Prozentsatz auf 15%. ABT-263 allein war für unbehandelte, wuchernde Zellen nicht toxisch.

Darüber hinaus wollten wir zeigen, dass die Fluoreszenz-Antikörper-Co-Färbung mit dem DDAOG-Seneszenztest kompatibel ist, um das Screening von TIS-assoziierten oder neuartigen Oberflächenmarkern zu erleichtern. Hier wurden B16-F10 Mausmelanomzellen erneut 4 Tage lang mit TIS-induzierender ETO (oder Vehikel) behandelt. Dann wurden die Zellen sowohl mit DDAOG gefärbt, um TIS zu bewerten, als auch mit einem fluoreszierenden Antikörper, um den TIS-assoziierten Oberflächenmarker DPP422 zu erkennen (Abbildung 5). Anti-DPP4 konjugiert zu R-Phycoerythrin (PE) wurde verwendet, und wir bestätigten eine vernachlässigbare Überlappung von PE mit DDAOG und AF auf dem verwendeten Durchflusszytometer (ergänzende Abbildung S2). Ein Histogramm der PE-Kanaldaten (Abbildung 5A) für >5.000 lebensfähige Zellen zeigte, dass 42% der ETO-behandelten Zellen DPP4+ waren (wobei die reine Vehikelprobe verwendet wurde, um das Positivitätsgate zu setzen). Die Visualisierung von 2D-Punktdiagrammen für die gleichen Proben (Abbildung 5B,C) zeigte, dass 44% der ETO-behandelten Zellen doppelt positiv für DDAOG (d.h. seneszent) und DPP4 gegenüber 4% der reinen Vehikelzellen waren. Diese Daten zeigen, dass eine Lebendzellfärbung mit Oberflächenmarker-Antikörpern in Kombination mit dem DDAOG-Seneszenztest möglich ist.

Mögliche Bedenken bei jeder Lebendzellfärbemethode sind der Zelltod, der während langer Analysesitzungen (>1 h) auftritt, und die effizienteste Färbung und Analyse von Proben über viele verschiedene Zeitpunkte (bis zu Tagen). Die lösungsmittelbasierte Fixierung von gefärbten Zellen adressiert beide Bedenken, da Proben fixiert werden können, sobald sie gefärbt sind, und dann im Kühlschrank gelagert werden können, bis sie in einer temperaturstabilen Charge analysiert werden. So testeten wir, ob mit DDAOG gefärbte lebende Zellen mit 100% Methanol oder 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert und bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden können. Unerwünschterweise verringerte die Methanolfixierung das DDAOG-Signal und reduzierte den Vorhofflimmern signifikant (Daten nicht gezeigt); Daher sollte die Verwendung von Methanol als Fixierungslösungsmittel vermieden werden. Die Fixierung mit PFA war jedoch viel erfolgreicher, wie in Abbildung 6 für Zellen zu sehen ist, die 10 Minuten nach der Färbung mit DDAOG in 4% PFA fixiert waren. Im Vergleich zu unfixierten Kontrollproben (Abbildung 6A; unbehandelt, 5% und BLM, 67% DDAOG HI AFHI) ZEIGTEN FIXIERTE Proben (Abbildung 6B) einen etwas höheren Hintergrund in unbehandelten Zellen (9%) und auch einen höheren Prozentsatz von Zellen, die in BLM-behandelten Zellen als seneszent bewertet wurden (80%). Dieser Effekt wurde auch bei festen Proben beobachtet, die über Nacht gelagert wurden (Abbildung 6C; unbehandelt, 12% und BLM, 72%) und 1 Woche lang bei 4 °C gelagert wurden (Abbildung 6D; 14% und 70%). Trotz des leichten Anstiegs der Fluoreszenz, der durch die PFA-Fixierung verursacht wurde, war die Induktion der Seneszenz durch BLM in allen fixierten Proben im Vergleich zur übereinstimmenden unbehandelten Probe immer noch offensichtlich. Darüber hinaus blieben die Zellen in der Lagerung intakt, wobei sich die Zellen bis Tag 7 nur geringfügig verschlechterten, und es wurde keine problematische Aggregation beobachtet. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Bequemlichkeit der Fixierung und Lagerung von Zellproben für eine spätere Batch-Analyse die Tolerierung des etwas höheren Hintergrunds durch PFA-Fixierung rechtfertigt, insbesondere in Experimenten mit vielen Proben oder Zeitpunkten.

Eine häufige Herausforderung in der zellbasierten Seneszenzforschung ist der heterogene Beginn der Seneszenz in Zellpopulationen. Hier zeigen wir, dass DDAOG für FACS von lebensfähigen seneszenten Zellen verwendet werden kann und dass gesammelte Zellen in Kultur für nachgeschaltete In-vitro-Assays überleben (Abbildung 7). Um Zellen nach FACS zu sortieren, werden die Zellen wie beschrieben behandelt und gefärbt und von einem FACS-fähigen Durchflusszytometer unter Verwendung der hier gezeigten DDAOG versus AF-Gating-Strategie sortiert (Abbildung 7A). Da hier aus Gründen der Langzeittoxizität keine Rentabilitätssonde verwendet wird, empfehlen wir, vor dem endgültigen seneszenten Zell-Gating (ergänzende Abbildung S3) eine strenge Streugating durchzuführen, um falsch-positive Trümmer aus den gesammelten Zellen zu entfernen. Dies sind Standard-FACS-Gating-Verfahren, die einem mäßig erfahrenen Benutzer vertraut sein sollten und schnell mit Software am Gerät eingerichtet werden können (<10 min).

Nach dem Sortieren einer Probe von BLM-behandelten A549-Zellen brachten wir die Zellen für 5 Tage (n = 6 Replikate) bei 10 × 103 Zellen/cm2 in Standard-Multiwell-Schalen zur Kultur zurück. Unsortierte Kontrollen wurden mit der gleichen Dichte plattiert, nebeneinander gezüchtet und unbehandelte und BLM-behandelte Zellen eingeschlossen. Zellen wurden täglich beobachtet; Für sortierte Zellen wurde kein signifikanter Zelltod oder eine Rückkehr zur Proliferation beobachtet. Sortierte Zellen blieben im Laufe von 5 Tagen in Kultur spärlich (d.h. nicht proliferierend), während unbehandelte und BLM-behandelte Zellen wie gezeigt konfluent wurden. An Tag 5 wurden die Zellen in PFA fixiert und auf Morphologie- und Proliferationsmarker gefärbt (Abbildung 7B). Die charakteristische vergrößerte Morphologie sortierter Zellen wurde durch fluoreszierende Phalloidin-Färbung von filamentösem Aktin aufgedeckt, wobei die DAPI-Färbung vergrößerte Kerne zeigte. Die sortierten Zellen hatten einen sehr großen Durchmesser (>10 μm) mit einem charakteristischen abgerundeten Aussehen. Wie erwartet, zeigte die Ki67-Antikörperfärbung einen vollständigen Verlust des Proliferationsmarkers in der sortierten Probe gegenüber einem teilweisen Verlust in der unsortierten BLM-behandelten Probe, und normale Ki67-Spiegel wurden in vielen Zellen in der unbehandelten unsortierten Probe beobachtet. Mindestens drei Bilder wurden pro Bohrloch unter Verwendung einheitlicher Bildgebungseinstellungen für alle Proben aufgenommen. Repräsentative Bilder werden gezeigt (Abbildung 7B).

Schließlich untersuchten wir, ob alternde Zellen, die in Tumoren entstehen, die in Mäusen etabliert wurden, die mit Chemotherapeutika behandelt wurden, mit DDAOG identifiziert werden konnten. B16-F10-Melanomtumoren wurden in der Flanke von C57/BL6-Mäusen induziert, die dann dreimal (i.p., alle 5 Tage) nur mit Kochsalzlösung (Abbildung 8A), DOX (Abbildung 8B) oder PLD (Abbildung 8C) behandelt wurden. Nach der dritten Behandlung erholten sich die Mäuse für 7 Tage, um den Beginn der Seneszenz zu ermöglichen, und wurden dann geopfert und Tumore herausgeschnitten. Die Tumore wurden halbiert, wobei die Hälfte zur Herstellung von gefrorenen Objektträgern für die X-Gal-Färbung verwendet wurde (Abbildung 8) und zur Hälfte in einzellige Suspensionen dissoziiert und mit DDAOG gefärbt wurde (Abbildung 8 und ergänzende Abbildung S4). Die X-Gal-Färbung in Geweben war trotz einer langen Färbedauer (72 h) eher schwach, aber die blaue Färbung zeigte sich bei DOX- und PLD-Tumoren bei näherer Untersuchung, insbesondere bei Tumoren, die auch im DDAOG-Flusstest positiv für die Seneszenz bewertet wurden (Abbildung 8B, C). Pro Gewebeobjektträger wurden mindestens drei Bilder aufgenommen und repräsentative Bilder gezeigt.

Im Vergleich zu X-Gal war DDAOG eine empfindlichere und genauere Methode zur Quantifizierung der Seneszenz in Tumoren (Abbildung 8). Für die DDAOG-Tumoranalyse wurde der mit Kochsalzlösung behandelte Tumor mit dem höchsten Fluoreszenzhintergrund verwendet, um das Seneszenzgate auf <5% einzustellen, so dass die anderen mit Kochsalzlösung behandelten Tumoren nicht über 5% Seneszenz lagen. Dieses Seneszenz-Gate wurde dann chargenweise auf gated lebensfähige Zellen aus allen Tumoren angewendet. Beide Chemotherapeutika induzierten Seneszenz in einigen Tumoren (zwei von fünf Tumoren für DOX, drei von fünf für PLD), wobei der Prozentsatz der alternden Tumorzellen zwischen 3% und 36% pro Tumor variierte. Zytometrische Datendiagramme für alle 15 Tumoren sind in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt, und eine Zusammenfassung der Tumorzytometriedaten ist in Abbildung 8D dargestellt (n = 5; (*) p < 0,05 vs. reine Kochsalzlösung Kontrollgruppe nach dem F-Varianztest). Wir schlussfolgern, dass DDAOG versus AF-Durchflusszytometrie eine akzeptable Methode zum Screening von Tumoren und Chemotherapeutika auf die Induktion von Seneszenz in vivo ist.

Figure 2
Abbildung 2: DDAOG ist eine empfindliche und spezifische Färbung für SA-β-Gal. (A) Konventionelle Färbung für SA-β-Gal mit X-Gal mit unbehandelten (links) oder ETO-behandelten (rechts) B16-F10-Melanomzellen. Durch ETO induzierte Seneszenz: Zellen zeigen eine vergrößerte Morphologie und blaue Färbung aufgrund der Spaltung von X-Gal durch erhöhte SA-β-Gal. Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Fluoreszierende Färbung für SA-β-Gal in ETO-behandelten Zellen entweder mit C12-FDG (515 nm Emission, grün) oder DDAOG (660 nm, rot). Die Färbeverteilung ist für beide Sonden ähnlich, was darauf hindeutet, dass DDAOG SA-β-Gal ähnlich wie C12-FDG detektiert. (C) Bewertung von Vorhofflimmern in ungefärbten, ETO-behandelten Zellen entweder im grünen (525 nm Emission, links) oder fernroten (660 nm, rechts) Emissionskanal. AF von Lipofuszin ist hoch im grünen Emissionskanal und vernachlässigbar im fernroten Kanal. Belichtungszeit = 2.000 ms für jedes Bild. Maßstabsbalken = 10 μm. Diese Abbildung ist nachgedruckt aus Flor und Kron23. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; X-Gal = 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid; UNT = unbehandelt; ETO = Etoposid; AF = Autofluoreszenz; C12-FDG = 5-Dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Aufbau der Durchflusszytometer-Datenerfassung. (A) Repräsentative Streudiagrammverteilung der Zellen. FSC-A ist eine Anzeige des Zellvolumens, und SSC-A zeigt die zelluläre Granularität an. Linkes Bild, reine Fahrzeugbehandlung von A549-Zellen. Rechtes Bild, ETO-Behandlung zur Induktion der Seneszenz. Beachten Sie den Trend zu einem vergrößerten Zellvolumen von ETO-behandelten Zellen, in Übereinstimmung mit der vergrößerten Morphologie, die aus der Mikroskopie ersichtlich ist. (B) Optionale Verwendung von kommerziellen "Regenbogen"-Fluoreszenz-Kalibriermikrosphären mit 5 Spitzen zur Einstellung der Detektorspannungen des Zytometers. In jedem verwendeten Fluoreszenzkanal sollte der maximale Peak ≤1 x 105 relative Fluoreszenzeinheiten eingestellt werden, indem die Zytometerdetektorspannung während des Probenlaufs eingestellt wird. Linkes Feld, BV421 (violetter) Kanal; Mitte, FITC (grüner) Kanal; rechts, APC-Kanal (rot). Die fünf fluoreszierenden Peaks sollten einen deutlichen Abstand aufweisen, wie gezeigt. (C-E) Repräsentative Einkanal-Fluoreszenzdaten für die (C)-Lebensfähigkeitsfärbung mit violettem CV450-Farbstoff; (D) grüne Autofluoreszenz von Zellen; (E) fernrotes Signal von DDAOG, das SA-β-Gal erkennt. Dunkleres Farbhistogramm, reine Fahrzeugbehandlung; helleres Farbhistogramm, ETO-Behandlung. Übergeordnete Tore sind über jedem Diagramm angegeben. Abkürzungen: FSC-A = Forward Scatter-Peak-Area; SSC-A = Seitenstreu-Peak-Fläche; ETO = Etoposid; BV421-A = Brilliant Violet 421 Kanal Peakfläche; FITC-A = Fluorescein-Isothiocyanat-Kanal-Peakfläche; APC-A = Allophycocyanin-Kanal-Peak-Area; AF = Autofluoreszenz; DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; VEH = Fahrzeug. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Daten für den Seneszenztest der Durchflusszytometrie . (A) B16-F10 murine Melanomzellen, die nur mit (oben links) Vehikel, (oben rechts) ETO, (unten links) nur ABT-263 (1 μM) oder (unten rechts) ETO plus ABT-263 behandelt wurden. (B) A549 menschliche Lungen-Adenokarzinomzellen, die nur mit (oben links) Vehikel, (oben rechts) BLM, (unten links) nur ABT-263 oder (unten rechts) BLM plus ABT-263 behandelt wurden. (A,B) Rechteckige Tore im oberen rechten Quadranten aller Diagramme definieren seneszente Zellen (DDAOGHI AFHI). Der Prozentsatz der alternden Zellen (der gesamten lebensfähigen Zellen pro Probe) ist auf jeder Fläche angegeben. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; ETO = Etoposid; BLM = Bleomycin; VEH = Fahrzeug; TIS = therapieinduzierte Seneszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Co-Färbung eines Beispielzelloberflächenmarkers mit Seneszenztest. (A) Immundetektion des Seneszenzmarkers DPP4 auf der Oberfläche lebensfähiger B16-F10-kultivierter Zellen; dunkelorange, nur Fahrzeug; hellorange, ETO. (B,C) Mitte und rechtes Bild: Zellen kogefärbt mit DDAOG und Anti-DPP4:PE. DDAOG HI DPP4HI-Zellen sind in rechteckigen Gattern enthalten, die auf den Diagrammen dargestellt sind, und der Prozentsatz der doppelt positiven Zellen pro Probe wird angegeben. Gezeigt: lebensfähige Zellen. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; ETO = Etoposid; VEH = Fahrzeug; DPP4 = Dipeptidylpeptidase 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Postfärbe-Fixierung und Lagerung von DDAOG-gefärbten Zellproben zur späteren Analyse. (A) Kontrolle, unfixierte Proben von lebenden A549-Zellen, die entweder unbehandelt (links) oder mit BLM (rechts) behandelt wurden, um Seneszenz zu induzieren, und dann gefärbt und sofort mit dem DDAOG-Protokoll analysiert (ohne Fixierung, Tag 0). (B) Proben, die gemäß (A) vorbereitet und dann sofort in 4% Paraformaldehyd fixiert und analysiert werden (Tag 0). c) Proben, die gemäß Buchstabe A vorbereitet, sofort in 4 % Paraformaldehyd fixiert und vor der Analyse über Nacht bei 4 °C gelagert werden. (D) Proben, die gemäß Buchstabe A vorbereitet, sofort fixiert und 7 Tage vor der Analyse gelagert werden. Rechteckige Gatter im oberen rechten Quadranten aller Diagramme definieren seneszente Zellen (DDAOGHI AFHI). Der Prozentsatz der alternden Zellen wird auf jeder Fläche angegeben. Abkürzungen: TIS = therapieinduzierte Seneszenz; DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; BLM = Bleomycin; AF = Autofluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Durchflusszytometrische Sortierung und Validierung angereicherter seneszenter Zellpopulationen. (A) Durchflusszytometrische Sortierdaten, die (links) die unbehandelte, DDAOG-gefärbte Kontrolle zeigen, die verwendet wurde, um das Gate für die seneszente Zellsortierung einzustellen (<5% seneszente Zellen in der abgegrenzten Region) und (rechts) die BLM-behandelte, DDAOG-gefärbte Probe, die wie gezeigt mit dem Sortiertor sortiert wurde. (B) Fluoreszenzmikroskopische Bilder für (linke Spalte) Zellen, die mit Phalloidin-Alexa Fluor 647 (orange Pseudofarbe) gefärbt wurden, um F-Aktin und DAPI (blau) nachzuweisen, um Kerne zu konfärben, die eine vergrößerte Morphologie von seneszenten Zellen zeigen, oder (rechte Spalte) Zellen, die mit Kaninchen Ki67 Antikörper und Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 gefärbt wurden, um den Verlust der Proliferation in seneszenten Zellen zu erkennen. Obere Reihe, unbehandelte und unsortierte Zellen. Mittelreihe, BLM-behandelte und unsortierte Zellen. Untere Reihe, BLM-behandelte und sortierte Zellen. Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: TIS = therapieinduzierte Seneszenz; DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; BLM = Bleomycin; UNT = unbehandelt; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Quantifizierung der Seneszenz in Tumoren von Mäusen, die mit Chemotherapeutika behandelt wurden. B16-F10-Melanomtumoren wurden in den Flanken von C67BL / 6-Mäusen etabliert, die dann alle 5 Tage plus 1 Woche mit drei Dosen (A) Kochsalzlösung, (B) DOX oder (C) PLD behandelt wurden, um den Beginn der Seneszenz zu ermöglichen. Tumore wurden herausgeschnitten und halbiert; Gefrorene Gewebeobjektträger wurden von einer Hälfte für die X-Gal-Färbung (obere Reihe) und die andere Hälfte für die DDAOG-Färbung (untere Reihe) dissoziiert. In X-Gal-gefärbten Bildern sind blaue Zellen SA-β-Gal HI-seneszente Zellen, während braune Regionen auf Melanin in Tumoren zurückzuführen sind. Repräsentative Ergebnisse werden für DOX und PLD von zwei Tumoren pro Gruppe gezeigt, die Seneszenz aufwiesen. Alle reinen Kochsalzlösungstumoren zeigten eine vernachlässigbare Seneszenz. (D) Quantifizierung der Seneszenz in medikamentös behandelten Tumoren von Mäusen. (*) p < 0,05 durch F-Varianztest, n = 5 Mäuse pro Gruppe. Fehlerbalken, Mittelwert ± REM. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; DOX = Doxorubicin; PLD = PEGyliertes liposomales Doxorubicin; X-Gal = 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid; AF = Autofluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung S1: Chemische Struktur der DDAOG-Sonde. DDAOG ist ein Konjugat aus 7-Hydroxy-9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on) und Beta-Galactosid. Bei der Spaltung durch Beta-Galaktosidase zeigt das hydrolysierte Spaltprodukt eine 50 nm tiefrote Fluoreszenzverschiebung, die seine spezifische Detektion mit Anregung über 600 nm ermöglicht. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Spektralabtastung von DDAOG-Übersprechen mit anderen fluoreszierenden Kanälen des Durchflusszytometers. Um verfügbare Kanäle für den Nachweis fluoreszierender Antikörper zu identifizieren, wurde ein Spektralscan auf einem 4-Laser-, 15-Kanal-Durchflusszytometer mit A549-Zellen durchgeführt, die mit BLM behandelt und mit DDAOG (rot) oder ungefärbt (schwarz) gefärbt wurden. In jedem Kanal des Durchflusszytometers wurden Daten für 10.000 Zellen erfasst. (A) Emissionskanäle des 405-nm-Lasers: von links nach rechts, BV421, BV510, BV605, BV660 und BV711. Das in den Kanälen BV605, BV660 und BV711 beobachtete Übersprechen macht sie für eine kompensationslose Co-Färbung mit DDAOG ungeeignet. BV421 und BV510 eignen sich für die Co-Färbung (beachten Sie, dass BV421 typischerweise für die Viabilitätsfärbung verwendet wird). (B) Emissionskanäle des 488-nm-Lasers: FITC und PerCP-Cy5. Für den PerCP-Cy5-Kanal wurde ein hohes Übersprechen beobachtet. FITC eignet sich zur Co-Färbung; Beachten Sie jedoch, dass der FITC-Kanal typischerweise im DDAOG-Assay zur Bewertung des grünen Emissions-AF verwendet wird. (C) Emissionskanäle des 561-nm-Lasers: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 und PE-Cy7. Die Kanäle PE und PE-Dazzle 594 eignen sich für den Nachweis von Antikörpern, die mit diesen Fluorophoren markiert sind (PE wird in dieser Studie für den Nachweis von DPP4 nachgewiesen). (D) Emissionskanäle des 640-nm-Lasers: APC, APC-H700 und APC-Cy7. Das DDAOG-Signal der seneszenten Zellen ist im APC-Kanal sichtbar (47,8% seneszent). Das Signal überlappt sich mit den Kanälen APC-H700 und APC-Cy7, wodurch sie für die Co-Färbung ohne signifikante spektrale Kompensation ungeeignet sind. Abkürzungen: BLM = Bleomycin; BV = Brillantes Violett; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; PerCP = Peridinin-Chlorophyll-Protein; PE = Phycoerythrin; DZ594 = Dazzle 594; APC = Allophyocyanin; AF = Autofluoreszenz; DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Cell Gating Strategie für die FACS-Sortierung von alternden Zellen. Das Passieren einer Zellsuspension durch ein empfindliches FACS-Zytometer kann eine zusätzliche Ansteuerung erfordern, um die Reinheit der Sortierung und eine optimale Instrumentenfunktionalität zu gewährleisten. Hier wird eine Beispielstrategie gezeigt. Andere Strategien sind möglich, abhängig von den Herstellerempfehlungen für das verwendete FACS-Zytometer. Linke Spalte, nur mit Vehikel behandelte Zellkontrolle. Rechte Spalte, A549-Zellen, die mit BLM behandelt wurden, um die Seneszenz zu induzieren, sortiert zu werden. (A) FSC-A (Zellvolumen) versus SSC-A (Zellgranularität) Gating intakter Zellen. Das intakte Gate eliminiert Zelltrümmer aus der sortierten Probe. (B) FSC-A versus FSC-H Reinheitsgating; Entfernt Dubletten und Ablagerungen. (C) SSC-A versus SSC-H Reinheitsgating; Entfernt Dubletten und Ablagerungen. (D) Gating für die interessierende Grundgesamtheit unter Verwendung des APC-A-Kanals (637 nm Anregung, 670 nm ± 30 nm Emission, verwendet für DDAOG) versus FITC-A-Kanal (488 nm Anregung, 530 nm ± 30 nm Emission, verwendet für AF); Entfernt mögliche Färbeartefakte. (E) Seneszenzzellen-Gating für die abschließende Sortierung. Abkürzungen: FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; BLM = Bleomycin; FSC-A = Vorwärts-Streu-Peak-Fläche; SSC-A = Seitenstreu-Peak-Fläche; FSC-H = Vorwärts-Streu-Peak-Höhe; SSC-H = Seitenstreu-Peak-Höhe. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: DDAOG Seneszenz-Durchflusszytometrie-Färbung von Tumoren. Durchflusszytometrie-Daten für ≥50.000 lebensfähige Tumorzellen. Seneszentes Zelltor, oberer rechter Quadrant jeder Parzelle. Der Prozentsatz der seneszenten (lebensfähigen) Tumorzellen wird innerhalb des Gates angezeigt. Tumorbehandlungen umfassten (A) nur Kochsalzlösung; b) DOX; und (C) PLD. Die Mäuse wurden dreimal behandelt, einmal alle 5 Tage, mit 7 Tagen für die Genesung, um den Beginn der Seneszenz vor dem Opfer zu ermöglichen. Fünf Tumoren pro Erkrankung wurden analysiert. Abkürzungen: AF = Autofluoreszenz; DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; DOX = Doxorubicin; PLD = PEGyliertes liposomales Doxorubicin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

In den letzten zehn Jahren hat sich die Durchflusszytometrie aufgrund der zunehmenden Popularität der Tumorimmunologie, der Entwicklung kostengünstigerer Durchflusszytometer und der Verbesserung gemeinsamer Instrumentierungseinrichtungen an akademischen Einrichtungen zu einer immer häufigeren Assay-Plattform in der Krebsforschung entwickelt. Multicolor-Assays sind jetzt Standard, da die meisten neueren Instrumente mit violetten, blau-grünen und roten bis fernroten optischen Arrays ausgestattet sind. Daher ist dieses DDAOG-Protokoll wahrscheinlich mit einer Vielzahl von Durchflusszytometern kompatibel. Natürlich sollte jedes Durchflusszytometer vom Benutzer ausgewertet werden. Besondere Vorsicht ist geboten, wenn dem DDAOG-Assay zusätzliche Fluorophore (z. B. fluoreszierende, konjugierte Antikörper) zugesetzt werden. Eine Bewertung des Fluorophor-Übersprechens zwischen den Kanälen sollte unter Verwendung von einfachgefärbten Kontrollen durchgeführt werden, die in allen anderen relevanten Kanälen visualisiert werden. Wenn eine Überlappung beobachtet wird, kann eine spektrale Kompensation20 zur Korrektur nach typischen Methoden durchgeführt werden.

Die hierin gezeigten Ergebnisse sollen in erster Linie zeigen, dass der DDAOG-Durchflusszytometrie-Assay schnelle, quantitative und leicht zu interpretierende Ergebnisse für TIS liefern kann, die durch Chemotherapeutika in Zellen oder Tumoren induziert werden. Die hier verwendeten Wirkstoffe, einschließlich ETO 23,24, DOX 7,25 und BLM 26,27, wurden dokumentiert, um TIS in verschiedenen Krebszelllinien 24 zu induzieren. Um die Spezifität der DDAOG-Sonde zu demonstrieren, wurde gezeigt, dass das bekannte senolytische Mittel ABT-26321 seneszente Zellen in Kultur selektiv eliminiert. Diese Arbeit demonstriert die Verwendung einer murinen (B16-F10) und einer menschlichen (A549) kultivierten Krebszelllinie sowie von B16-F10-Tumoren, die in Mäusen etabliert wurden. Es können jedoch alle Zellen verwendet werden, die β-Gal exprimieren und durch eine Standard-Durchflusszytometrie-Probenvorbereitung lebensfähig bleiben. Bestimmte Zelltypen können zerbrechlicher oder weniger anfällig für TIS sein, und dies sollte bewertet werden, bevor Sie mit einem großen Bildschirm oder einer Studie beginnen. Wenn Zellen in der Vorbereitung zerfallen, die Lebensfähigkeit schlecht ist oder TIS viel niedriger ist als bei Positivmittelkontrollen erwartet, ist der Zelltyp möglicherweise kein ideales Modell für Studien der Seneszenz. Die hier gezeigten Wirkstoffe und Zelllinien können von anderen Gruppen als Kontrollen beim weiteren Screening potenzieller TIS-induzierender Wirkstoffe oder neuartiger Senolytika verwendet werden, was nach wie vor ein aktives Ziel in diesem Bereich ist.

Die durch Chemotherapeutika induzierte Toxizität kann je nach Zelltyp variieren und die Assay-Ergebnisse beeinflussen. Wenn die primäre beobachtete Wirkung des verwendeten Mittels und/oder der verwendeten Konzentration der akute Zelltod ist, kann die Gesamtseneszenz minimal sein. In vivo soll eine hohe Tumornekrose oder systemische Toxizität bei Tieren durch Senkung der Wirkstoffdosierung vermieden werden. Der Schlüssel zum Assay-Erfolg ist die Prüfung einer Reihe von Wirkstoffkonzentrationen mit sorgfältiger Prüfung der Rentabilitäts-Assay-Daten (z. B. wie von CV450 im DDAOG-Assay bereitgestellt). Wenn sich in vitro viele tote Zellen während der Behandlung von der Platte lösen, einschließlich des Kulturmediums in der analysierten Probe, ist es wichtig, den Zelltod insgesamt zu bewerten. CV450 ist nicht die einzige Lebensfähigkeitsfärbung, die mit diesem Assay kompatibel ist; Andere violett/blau emittierende Fluorophore können verwendet werden. Reparierbare Lebensfähigkeitssonden können auch verwendet werden, wenn der Benutzer plant, die gefärbten Proben mit PFA zu fixieren, vorausgesetzt, die Sondenfluoreszenz überschneidet sich nicht signifikant mit DDAOG oder AF (oder der Benutzer führt eine spektrale Kompensation durch, um Überlappungen zu korrigieren). In einigen Fällen, in denen die Wirkstofftoxizität gering und die Zellen robust sind, kann es ausreichen, intakte Zellen durch Lichtstreuung (FSC vs. SSC) zu gating, um "lebensfähige" Zellen für die Analyse zu isolieren.

Ein wichtiger Schritt in diesem In-vitro-Protokoll besteht darin, Zellen im unteren Bereich der logarithmischen Wachstumsdichte (typischerweise 2 × 10 3-5 × 103 Zellen / cm2) zu platten, um eine schnelle anfängliche Proliferation zu ermöglichen, was die Aufnahme des Chemotherapeutikums durch die meisten Zellen erleichtert. Nach der Behandlung ist es auch wichtig, Zeit für den Beginn der TIS einzuplanen: in vitro, 4 Tage ± 1 Tag in Gegenwart des Arzneimittels; in vivo, 7 Tage der Genesung nach der letzten Chemotherapie. Nach der Färbung mit DDAOG wie beschrieben sollte eine quantitative Analyse der zytometrischen Daten wie gezeigt durchgeführt werden, d. H. Gating DDAOG versus AF-Zellen in jeder Probe, um den Prozentsatz der alternden Zellen (der Gesamtlebensfähigkeit) zu bestimmen. Zu den optionalen Schritten gehören die Verwendung fluoreszierender "Regenbogen"-Kalibriermikrosphären zur Standardisierung der Durchflusszytometrie, die PFA-Fixierung von gefärbten Proben, die Co-Immunfärbung für Oberflächenmarker und die Flusssortierung zur Anreicherung seneszenter Zellen für nachgeschaltete Assays. Jeder dieser optionalen Schritte bietet jedoch in bestimmten Anwendungen entscheidende Vorteile. Die Kalibriermikrosphären standardisieren den Zytometrieaufbau über mehrere Sitzungen hinweg und ermöglichen es dem Benutzer, zunächst Spannungen in einem nützlichen Bereich für die Seneszenz- und Lebensfähigkeitserkennung einzustellen, mit minimalen Anpassungen danach. Die PFA-Fixierung von Proben stabilisiert die Zellen und ermöglicht eine Batch-Analyse großer Zellgruppen zu einem späteren Zeitpunkt. Die Co-Immunfärbung für Oberflächenmarker kann verwendet werden, um nach neuen Seneszenz-bezogenen Proteinen und Immuninteraktionen zu suchen. In zukünftigen Studien planen wir, die Co-Färbung von intrazellulären Seneszenzmarkern mit DDAOG zu validieren.

Die Sortierung von TIS-Zellen nach FACS ermöglicht die Anreicherung lebensfähiger TIS-Zellen aus heterogenen Populationen, was die Messwerte für nachgeschaltete Assays wie Western Blotting, Proteomik oder Transkriptomik verwirren kann. Nach der Sortierung wurde keine signifikante Toxizität von DDAOG in TIS-Zellen beobachtet, die bis zu 5 Tage lang wieder in Kultur gebracht wurden. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass sortierte Zellen mit Baf, internalisiertem DDAOG (das von SA-β-Gal zu DDAO, einem Acridinfarbstoff, gespalten wird) behandelt und mechanischer Belastung durch das FACS-Instrument ausgesetzt wurden. Daher können bestimmte biologische Veränderungen, die nicht mit der Seneszenz zusammenhängen, in den sortierten Zellen vorhanden sein. In dieser Studie behielten die sortierten Zellen jedoch starke Merkmale der Seneszenz bei und lieferten charakteristische Proteomik- und Transkriptomik-Ergebnisse28 im Vergleich zu unsortierten Kontrollen. Trotz des etwas offensichtlichen Nutzens der Verwendung von FACS zur Sammlung und Analyse alternder Zellen von Tumoren wurde dieses Verfahren in der Literatur selten verwendet. Einige Gruppen haben p16Ink4a Luciferase oder fluoreszierende Reporter verwendet, um alternde Zellen in Mausgeweben zu identifizieren, wobei fluoreszierende Reporter in einigen Studien eine FACS-Sortierung ermöglichten29,30. Die Ergebnisse stimmen im Allgemeinen darin überein, dass TIS in Tumoren unabhängig vom Induktionsmittel oder Tumortyp ein partielles bis seltenes Ereignis ist und selten 100% der Tumorzellen erreicht31. Die FACS-Sortierung von Zellen mit der DDAOG-Methode ermöglicht die Entnahme seltener TIS-Zellen aus Tumoren, ohne dass transgene Konstrukte exprimiert werden müssen.

Derzeit wird die meiste Seneszenzforschung in Mausmodellen ex vivo mit einer Kombination von X-Gal und immunhistochemischen Markerndurchgeführt 32,33. Die Beurteilung von TIS ex vivo anhand von Tumorgeweben kann jedoch ein langwieriger Prozess sein, insbesondere wenn X-Gal verwendet wird. Dieses Verfahren erfordert Tumorkryokonservierung, Kryosektion auf Objektträgern, X-Gal-Färbung, Deckglasmontage, Trocknung, Bildgebung und Ritzung "blauer" Zellen - mindestens ein mehrtägiger Ansatz. Die Immunhistochemie ist nicht viel schneller oder einfacher, und für jeden Marker plus X-Gal in jedem Tumor müssen verschiedene Gewebeschnitte verwendet und bewertet werden, es sei denn, die Multiplexanalyse wird optimiert, was mehr Zeit am Front-End des Prozesses hinzufügt. Gewebeschnitte entnehmen nur einen dünnen Querschnitt des Tumors, während seneszente Zellen (wie viele Zelltypen) ungleichmäßig im 3D-Raum in Tumoren verteilt sein können29. Es ist dringend notwendig, von langsamen, veralteten histologischen Methoden zu einem schnelleren und leicht quantifizierbaren Seneszenztest für Tumore überzugehen. Mit Hilfe der DDAOG-Durchflusszytometrie konnte ein Satz von 15 Tumoren dissoziiert und gefärbt werden, um schlüssige, quantitative Seneszenzdaten in weniger als 1 Tag praktischer Zeit nach der Tumorernte zu erhalten. Eine Hälfte des Tumors wurde für jede Probe verarbeitet, wodurch die Probenahme des 3D-Raums pro Tumor verbessert wurde. Dieser DDAOG-Durchflusszytometrie-Ansatz ist zur Beurteilung von TIS in Tumoren deutlich schneller und zuverlässiger als Gewebeobjektträger-basierte Methoden.

Mit seinen vielen Vorteilen gegenüber X-Gal und anderen Methoden setzen wir uns dafür ein, dass das DDAOG-Protokoll zum neuen Goldstandard-Seneszenztest wird. Es verwendet sowohl den konventionell akzeptierten Seneszenzmarker SA-β-Gal als auch die markierungsfreie Detektion von altersassoziiertem Vorhofflimmern als zweiten Marker. Diese Fluorophore sind mit den meisten Standard-Durchflusszytometern kompatibel. Der Assay enthält eine Lebensfähigkeitsfärbung, um tote Zellen und Trümmer unter Verwendung von Proben auszuschließen, die leicht aus medikamentös behandelten kultivierten Zelllinien oder Tumoren gewonnen werden. Lebendzellproben können wahlweise lösungsmittelfixiert oder kryokonserviert werden, um die Batch-Analyse großer Studien zu erleichtern, z. B. unter Verwendung von Zeitpunkten zur Bewertung des Auftretens von TIS im Laufe der Zeit mit mehreren Wirkstoffen Der Färbeprozess dauert weniger als einen halben Tag Laborarbeit, und die Datenerfassung beträgt in der Regel <5 Minuten pro Probe. Die Datenanalyse ist ähnlich schnell und unkompliziert und liefert quantitative Daten über den Prozentsatz der TIS-Zellen pro Probe, ohne langwieriges Zell-Scoring und -Zählen. Proben können FACS-sortiert werden, um angereicherte Populationen von TIS-Zellen zu gewinnen, was das Rauschen durch zelluläre Heterogenität in nachgeschalteten Analysen reduziert. Wir glauben, dass der DDAOG-Assay in vielen Fällen X-Gal ersetzen und das Screening von TIS-induzierenden Wirkstoffen und Senolytika in vitro und in vivo erleichtern kann, was zu schnelleren und zuverlässigeren Entdeckungen auf dem Gebiet der Seneszenzforschung führt.

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Disclosures

Die Autoren haben für diese Studie keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Wir danken der Cytometry and Antibody Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Das Animal Research Center an der University of Chicago stellte Tierunterkünfte zur Verfügung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Krebsforschung Ausgabe 187 Seneszenz Krebs Chemotherapie Durchflusszytometrie Fluoreszenzsonde Multiplex
Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie
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Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,… More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

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