JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

تسجيل تيار البوتاسيوم المعتمد على الجهد على خلايا عضلة القلب H9c2 عبر تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة فعالة للاكتساب الديناميكي في الوقت الفعلي لتيارات قناة البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي (Kv) في خلايا عضلة القلب H9c2 باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة.

Abstract

تلعب قنوات البوتاسيوم على غشاء خلية عضلة القلب دورا مهما في تنظيم الأنشطة الكهربية للخلية. كونها واحدة من القنوات الأيونية الرئيسية ، ترتبط قنوات البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي (Kv) ارتباطا وثيقا ببعض أمراض القلب الخطيرة ، مثل تلف عضلة القلب الناجم عن الأدوية واحتشاء عضلة القلب. في الدراسة الحالية ، تم استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة لتحديد تأثيرات 1.5 mM 4-aminopyridine (4-AP ، مثبط قناة البوتاسيوم واسع الطيف) والأكونيتين (AC ، 25 μM ، 50 μM ، 100 μM ، و 200 μM) على تيار قناة Kv (IKv) في خلايا عضلة القلب H9c2. وجد أن 4-AP يثبط I Kv بحوالي 54٪ ، بينما أظهر التأثير المثبط للتيار المتردد على IKv اتجاها يعتمد على الجرعة (لا يوجد تأثير ل 25 ميكرومتر ، ومعدل مثبط 30٪ ل 50 ميكرومتر ، ومعدل مثبط 46٪ ل 100 ميكرومتر ومعدل تثبيط 54٪ ل 200 ميكرومتر). نظرا لخصائص الحساسية والدقة العالية ، ستعزز هذه التقنية استكشاف السمية القلبية والتأثيرات الدوائية للطب العرقي الذي يستهدف القنوات الأيونية.

Introduction

القنوات الأيونية هي بروتينات متكاملة خاصة مضمنة في الطبقة المزدوجة الدهنية لغشاء الخلية. في وجود المنشطات ، تشكل مراكز هذه البروتينات المتكاملة الخاصة مسام انتقائية للغاية محبة للماء ، مما يسمح للأيونات ذات الحجم والشحنة المناسبين بالمرور بطريقة نقل سلبية1. القنوات الأيونية هي أساس استثارة الخلية والكهرباء الحيوية وتلعب دورا رئيسيا في مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية2. يمد القلب الأعضاء الأخرى بالدم من خلال الانقباضات المنتظمة الناتجة عن عملية اقتران الإثارة والانقباض التي بدأتها جهود الفعل3. أكدت الدراسات السابقة أن توليد إمكانات الفعل في خلايا عضلة القلب ناتج عن التغير في تركيز الأيونات داخل الخلايا ، وأن تنشيط وتعطيل قنوات Na + و Ca2 + و K + أيون في خلايا عضلة القلب البشرية يؤدي إلى تكوين إمكانات الفعل في تسلسل معين4،5،6. يمكن لتيارات قناة البوتاسيوم المضطربة ذات الجهد الكهربائي (Kv) أن تغير إيقاع القلب الطبيعي ، مما يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب ، والذي يعد أحد الأسباب الرئيسية للوفاة. لذلك ، يعد تسجيل IKv أمرا بالغ الأهمية لفهم آليات الأدوية لعلاج عدم انتظام ضربات القلب الذي يهدد الحياة7.

قناة Kv هي عنصر مهم في قناة البوتاسيوم. تلعب وظيفة التنسيق لقناة Kv دورا مهما في النشاط الكهربائي وانقباض عضلة القلب لقلب الثدييات8،9،10. في خلايا عضلة القلب ، تعتمد سعة ومدة إمكانات الفعل على التوصيل المشترك لتيارات K + الخارجية بواسطة أنواع فرعية متعددة من قنوات Kv11. يعد تنظيم وظيفة قناة Kv مهما جدا لإعادة الاستقطاب الطبيعي لإمكانات عمل القلب. حتى أدنى تغيير في توصيل Kv يؤثر بشكل كبير على إعادة استقطاب القلب ويزيد من احتمال عدم انتظام ضربات القلب12,13.

تمثل طريقة أساسية في أبحاث الفيزيولوجيا الكهربية الخلوية ، يمكن إنشاء ختم عالي المقاومة بين منطقة صغيرة من غشاء الخلية وطرف ماصة لتسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة عن طريق تطبيق ضغط سلبي. الضغط السلبي المستمر يجعل غشاء الخلية يتلامس مع طرف الماصة ويلتصق بالجدار الداخلي للماصة. تسمح الدائرة الكهربائية الكاملة الناتجة للمرء بتسجيل أي تيار قناة أيونية واحدة عبر سطح غشاء الخلية14. تتمتع هذه التقنية بحساسية عالية جدا لتيار القناة الأيونية لغشاء الخلية ويمكن استخدامها للكشف عن التيارات في جميع القنوات الأيونية ، والتطبيقات واسعة للغاية15. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع وضع العلامات الفلورية ووضع العلامات المشعة ، يتمتع مشبك التصحيح بسلطة ودقة أعلى16. في الوقت الحاضر ، تم استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة للكشف عن مكونات الطب الصيني التقليدي التي تعمل على تيارات قناة Kv17،18،19. على سبيل المثال ، استخدم Wang et al. تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة وأكد أن المكون الفعال لبذور اللوتس قد يحقق تثبيط قناة Kv4.3 عن طريق منع قنوات الحالة المنشطة19. الأكونيتين (AC) هو أحد المكونات الفعالة والنشطة لأنواع الأكونيتوم ، مثل Aconitum carmichaeli Debx و Aconitum pendulum Busch. أظهرت العديد من الدراسات أن الجرعات الزائدة من التيار المتردد يمكن أن تسبب عدم انتظام ضربات القلب وحتى السكتة القلبية20. يؤدي التفاعل بين التيار المتردد والقنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي إلى تعطيل التوازن الأيوني داخل الخلايا ، وهو الآلية الرئيسية للسمية القلبية21. لذلك ، في هذه الدراسة ، يتم استخدام تقنية المشبك التصحيح للخلية الكاملة لتحديد آثار AC على IKv من خلايا عضلة القلب.

Protocol

تم تحضين خلايا عضلة القلب للفئران H9c2 التي تم الحصول عليها تجاريا (انظر جدول المواد) في DMEM التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2. ثم تم استخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة للكشف عن التغييرات في I<su…

Representative Results

سمح هذا البروتوكول بتسجيل IKv وفقا للمعايير المحددة في تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة. تم تشغيل IKv بواسطة 150 مللي ثانية من تحفيز النبض غير المستقطب من -40 إلى +60 مللي فولت عند إمكانية الاحتفاظ ب -60 مللي فولت (الشكل 3 أ). ظهر IKv لخلايا عضلة القلب للفئران H9c2 لأول…

Discussion

تستخدم تقنية الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح بشكل أساسي لتسجيل وعكس النشاط الكهربائي والخصائص الوظيفية للقنوات الأيونية على غشاء الخلية25. في الوقت الحاضر ، تشمل طرق التسجيل الرئيسية لتقنية مشبك التصحيح التسجيل أحادي القناة وتسجيل الخلية بأكملها26. بالنسبة…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نقدر الدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82130113) وبرنامج البحث والتطوير والتحول الرئيسي التابع لإدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة تشينغهاي (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
check_url/kr/64805?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image