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의학

Registrazione della corrente di potassio voltaggio-dipendente su cardiomiociti H9C2 tramite la tecnica del patch-clamp a cellule intere

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo efficiente per l’acquisizione dinamica e in tempo reale delle correnti del canale del potassio voltaggio-dipendente (Kv) nei cardiomiociti H9c2 utilizzando la tecnica patch-clamp dell’intera cellula.

Abstract

I canali del potassio sulla membrana cellulare miocardica svolgono un ruolo importante nella regolazione delle attività elettrofisiologiche cellulari. Essendo uno dei principali canali ionici, i canali del potassio voltaggio-dipendenti (Kv) sono strettamente associati ad alcune gravi malattie cardiache, come il danno miocardico indotto da farmaci e l’infarto del miocardio. Nel presente studio, la tecnica patch-clamp dell’intera cellula è stata impiegata per determinare gli effetti di 1,5 mM 4-aminopiridina (4-AP, un inibitore del canale del potassio ad ampio spettro) e aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM e 200 μM) sulla corrente del canale Kv (IKv) nei cardiomiociti H9c2. È stato riscontrato che il 4-AP ha inibito I Kv di circa il 54%, mentre l’effetto inibitorio dell’AC sull’IKv ha mostrato una tendenza dose-dipendente (nessun effetto per 25 μM, tasso inibitorio del 30% per 50 μM, tasso inibitorio del 46% per 100 μM e tasso inibitorio del 54% per 200 μM). A causa delle caratteristiche di maggiore sensibilità e precisione, questa tecnica promuoverà l’esplorazione della cardiotossicità e degli effetti farmacologici dell’etnomedicina che prendono di mira i canali ionici.

Introduction

I canali ionici sono speciali proteine integrate incorporate nel doppio strato lipidico della membrana cellulare. In presenza di attivatori, i centri di tali speciali proteine integrate formano pori idrofili altamente selettivi, consentendo agli ioni di dimensioni e cariche appropriate di passare attraverso in modo di trasporto passivo1. I canali ionici sono alla base dell’eccitabilità cellulare e della bioelettricità e svolgono un ruolo chiave in una varietà di attività cellulari2. Il cuore fornisce sangue ad altri organi attraverso contrazioni regolari derivanti da un processo accoppiato eccitazione-contrazione avviato da potenziali d’azione3. Studi precedenti hanno confermato che la generazione di potenziali d’azione nei cardiomiociti è causata dal cambiamento della concentrazione di ioni intracellulari e l’attivazione e l’inattivazione dei canali ionici Na+, Ca2+ e K+ nei cardiomiociti umani portano alla formazione di potenziali d’azione in una certa sequenza 4,5,6. Le correnti disturbate del canale del potassio voltaggio-dipendente (Kv) (IKv) potrebbero modificare il normale ritmo cardiaco, portando ad aritmie, che sono una delle principali cause di morte. Pertanto, la registrazione dell’IKv è fondamentale per comprendere i meccanismi dei farmaci per il trattamento di aritmie potenzialmente letali7.

Il canale Kv è un componente importante del canale del potassio. La funzione di coordinazione del canale Kv svolge un ruolo importante nell’attività elettrica e nella contrattilità miocardica del cuore dei mammiferi 8,9,10. Nei cardiomiociti, l’ampiezza e la durata dei potenziali d’azione dipendono dalla co-conduzione di correnti K+ verso l’esterno da parte di più sottotipi di canale Kv11. La regolazione della funzione del canale Kv è molto importante per la normale ripolarizzazione del potenziale d’azione cardiaco. Anche il minimo cambiamento nella conduttanza Kv influisce notevolmente sulla ripolarizzazione cardiaca e aumenta la possibilità di aritmia12,13.

Rappresentando un metodo fondamentale nella ricerca elettrofisiologica cellulare, un sigillo ad alta resistenza tra una piccola area della membrana cellulare e una punta di pipetta per la registrazione di patch-clamp a cellule intere può essere stabilito applicando una pressione negativa. La pressione negativa continua fa sì che la membrana cellulare entri in contatto con la punta della pipetta e si attacchi alla parete interna della pipetta. Il circuito elettrico completo risultante consente di registrare qualsiasi corrente di canale ionico singolo attraverso la superficie della membrana cellulare14. Questa tecnica ha una sensibilità molto elevata per la corrente del canale ionico della membrana cellulare e può essere utilizzata per rilevare correnti in tutti i canali ionici e le applicazioni sono estremamente ampie15. Inoltre, rispetto all’etichettatura fluorescente e all’etichettatura radioattiva, il patch-clamp ha maggiore autorità e precisione16. Allo stato attuale, la tecnica patch-clamp a cellule intere è stata utilizzata per rilevare i componenti della medicina tradizionale cinese che agiscono sulle correnti del canale Kv17,18,19. Ad esempio, Wang et al. hanno utilizzato la tecnica patch-clamp dell’intera cellula e hanno confermato che il componente efficace del seme di loto potrebbe raggiungere l’inibizione del canale Kv4.3 bloccando i canali di stato attivati19. L’aconitina (AC) è uno dei principi attivi ed efficaci delle specie di Aconitum, come Aconitum carmichaeli Debx e Aconitum pendulum Busch. Numerosi studi hanno dimostrato che overdose di AC può causare aritmie e persino arresto cardiaco20. L’interazione tra AC e canali ionici voltaggio-dipendenti porta alla rottura dell’omeostasi ionica intracellulare, che è il meccanismo chiave della cardiotossicità21. Pertanto, in questo studio, la tecnica patch-clamp dell’intera cellula viene utilizzata per determinare gli effetti dell’AC sui cardiomiociti IKv.

Protocol

I cardiomiociti di ratto H9c2 ottenuti commercialmente (vedere la tabella dei materiali) sono stati incubati in DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l’1% di penicillina-streptomicina a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2. La tecnica patch-clamp dell’intera cellula è stata quindi impiegata per rilevare i cambiamenti in IKv nelle cellule H9c2 normali e nelle cellule trattate con 4-AP o AC (Figura 1 e <stron…

Representative Results

Questo protocollo ha permesso la registrazione dell’IKv secondo i parametri impostati nella tecnica patch-clamp a tutta cella. L’IKv è stato attivato da 150 ms di stimolo impulsivo depolarizzante da -40 a +60 mV con un potenziale di mantenimento di -60 mV (Figura 3A). IKv dei cardiomiociti di ratto H9c2 sono apparsi per la prima volta intorno a -20 mV, e poi l’ampiezza è aumentata con un’ulteriore depolarizzazione. La relazione media tra IKv e po…

Discussion

La tecnica elettrofisiologica patch-clamp viene utilizzata principalmente per registrare e riflettere l’attività elettrica e le caratteristiche funzionali dei canali ionici sulla membrana cellulare25. Allo stato attuale, i principali metodi di registrazione della tecnica patch-clamp includono la registrazione a canale singolo e la registrazione a cella intera26. Per la modalità a cella intera, il microelettrodo di vetro e la pressione negativa vengono utilizzati per forma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Apprezziamo il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (82130113) e del Key R&D and Transformation Program del Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Qinghai (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
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Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
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Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
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