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의학

全細胞パッチクランプ法 による H9c2心筋細胞の電位依存性カリウム電流記録

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

本プロトコルは、全細胞パッチクランプ技術を使用して、H9c2心筋細胞における電位依存性カリウム(Kv)チャネル電流をリアルタイムかつ動的に取得するための効率的な方法を記載しています。

Abstract

心筋細胞膜上のカリウムチャネルは、細胞の電気生理学的活動の調節において重要な役割を果たす。主要なイオンチャネルの1つである電位依存性カリウム(Kv)チャネルは、薬物誘発性心筋損傷や心筋梗塞などのいくつかの深刻な心臓病と密接に関連しています。本研究では、全細胞パッチクランプ技術を使用して、H9c2心筋細胞のKvチャネル電流(IKv)に対する1.5 mM 4-アミノピリジン(4-AP、広域スペクトルカリウムチャネル阻害剤)およびアコニチン(AC、25 μM、50 μM、100 μM、および200 μM)の効果を決定しました。その結果、4-APはIKvを約54%阻害するが、ACのIKv阻害効果は用量依存的な傾向を示した(25μMでは効果なし、50μMでは30%の阻害率、100μMでは46%の阻害率、200μMでは54%の阻害率)を示した。本技術は、高感度・高精度という特性から、イオンチャネルを標的としたエスノメディシンの心毒性や薬理効果の探索を促進する。

Introduction

イオンチャネルは、細胞膜の脂質二重層に埋め込まれた特別な組み込みタンパク質です。活性化剤の存在下では、このような特殊な集積タンパク質の中心が選択性の高い親水性孔を形成し、適切なサイズと電荷のイオンが受動的な輸送様式で通過することを可能にします1。イオンチャネルは、細胞の興奮性と生体電気の基礎であり、さまざまな細胞活動において重要な役割を果たします2。心臓は、活動電位3によって開始される興奮収縮結合プロセスに起因する定期的な収縮を通じて他の臓器に血液を供給します。これまでの研究では、心筋細胞における活動電位の発生は細胞内イオン濃度の変化によって引き起こされ、ヒト心筋細胞におけるNa+、Ca2+、およびK+イオンチャネルの活性化および不活性化は、特定の配列で活動電位の形成につながることが確認されています4,5,6。電位依存性カリウム(Kv)チャネル電流(IKv)の乱れは、正常な心臓のリズムを変化させ、主要な死因の1つである不整脈を引き起こす可能性があります。したがって、IKvを記録することは、生命を脅かす不整脈を治療するための薬物のメカニズムを理解するために重要です7。

Kvチャネルはカリウムチャネルの重要な成分です。Kvチャネルの配位機能は、哺乳類の心臓の電気的活動および心筋収縮性において重要な役割を果たす8、9、10。心筋細胞では、活動電位の振幅と持続時間は、複数のKvチャネルサブタイプによる外向きのK+電流の共伝導に依存します11。Kvチャネル機能の調節は、心臓活動電位の正常な再分極にとって非常に重要です。Kvコンダクタンスのわずかな変化でさえ、心臓の再分極に大きな影響を与え、不整脈の可能性を高めます12,13。

細胞電気生理学的研究の基本的な方法である細胞膜の小さな領域と、全細胞パッチクランプ記録用のピペットチップとの間の高抵抗シールは、負圧を加えることによって確立することができる。連続的な負圧により、細胞膜がピペットチップに接触し、ピペットの内壁に付着します。結果として生じる完全な電気回路は、細胞膜14の表面を横切る任意の単一のイオンチャネル電流を記録することを可能にする。この技術は、細胞膜イオンチャネル電流に対して非常に高い感度を持ち、すべてのイオンチャネルの電流を検出するために使用でき、アプリケーションは非常に広いです15。さらに、蛍光標識や放射性標識と比較して、パッチクランプはより高い権威と精度を持っています16。現在、全細胞パッチクランプ技術は、Kvチャネル電流17,18,19に作用する伝統的な漢方薬成分を検出するために使用されています。例えば、Wangらは全細胞パッチクランプ技術を使用し、ハス種子の有効成分が活性化状態チャネル19を遮断することによってKv4.3チャネルの阻害を達成する可能性があることを確認した。アコニチン(AC)は、トリカブトカーミカエリデブックスやトリカブト振り子ブッシュなどのトリカブト種の効果的で有効成分の1つです。多くの研究は、ACの過剰摂取が不整脈や心停止さえ引き起こす可能性があることを示しています20。ACと電位依存性イオンチャネル間の相互作用は、心毒性の重要なメカニズムである細胞内イオン恒常性の破壊につながります21。したがって、この研究では、全細胞パッチクランプ技術を使用して、心筋細胞のIKvに対するACの影響を決定します。

Protocol

市販のH9c2ラット心筋細胞( 材料の表を参照)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM中で、5%CO2加湿雰囲気中で37°Cでインキュベートした。次に、全細胞パッチクランプ技術を使用して、正常なH9c2細胞および4-APまたはAC処理細胞におけるIKv の変化を検出しました(図1 および 図2)…

Representative Results

このプロトコルにより、全細胞パッチクランプ技術で設定されたパラメータに従ってIKvを記録することができました。IKvは、−60mVの保持電位で−40〜+60mVの150msの脱分極パルス刺激によってトリガーされました(図3A)。H9c2ラット心筋細胞のIKvは、最初に約-20 mVで出現し、その後、振幅はさらなる脱分極とともに増加しました。なお、IKvと?…

Discussion

パッチクランプ電気生理学的技術は、主に、細胞膜25上のイオンチャネルの電気的活動および機能的特性を記録および反映するために使用される。現在、パッチクランプ技術の主な記録方法には、シングルチャネル記録と全セル記録26が含まれます。全セルモードの場合、ガラス微小電極および負圧を使用して、細胞膜の小さな領域とピペットチップ<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

中国国家自然科学基金会(82130113)および青海省科学技術部の主要研究開発および変革プログラム(2020-SF-C33)からの財政的支援に感謝します。

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
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Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
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Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
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