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의학

Enregistrement du courant de potassium voltage-dépendant sur les cardiomyocytes H9C2 via la technique de patch-clamp à cellules entières

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Le présent protocole décrit une méthode efficace pour l’acquisition dynamique et en temps réel des courants des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) dans les cardiomyocytes H9c2 en utilisant la technique de patch-clamp à cellules entières.

Abstract

Les canaux potassiques sur la membrane cellulaire du myocarde jouent un rôle important dans la régulation des activités électrophysiologiques cellulaires. Étant l’un des principaux canaux ioniques, les canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) sont étroitement associés à certaines maladies cardiaques graves, telles que les lésions myocardiques induites par les médicaments et l’infarctus du myocarde. Dans la présente étude, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour déterminer les effets de 1,5 mM de 4-aminopyridine (4-AP, un inhibiteur des canaux potassiques à large spectre) et d’aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM) sur le courant du canal Kv (IKv) dans les cardiomyocytes H9c2. Il a été constaté que la 4-AP inhibait le I Kv d’environ 54%, tandis que l’effet inhibiteur de l’AC sur le IKv montrait une tendance dose-dépendante (aucun effet pour 25 μM, taux inhibiteur de 30% pour 50 μM, taux inhibiteur de 46% pour 100 μM et taux inhibiteur de 54% pour 200 μM). En raison des caractéristiques de sensibilité et de précision plus élevées, cette technique favorisera l’exploration de la cardiotoxicité et des effets pharmacologiques de l’ethnomédecine ciblant les canaux ioniques.

Introduction

Les canaux ioniques sont des protéines intégrées spéciales intégrées dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. En présence d’activateurs, les centres de ces protéines intégrées spéciales forment des pores hydrophiles hautement sélectifs, permettant aux ions d’une taille et d’une charge appropriées de passer à travers de manière passive1. Les canaux ioniques sont à la base de l’excitabilité cellulaire et de la bioélectricité et jouent un rôle clé dans une variété d’activités cellulaires2. Le cœur fournit du sang à d’autres organes par des contractions régulières résultant d’un processus couplé excitation-contraction initié par des potentiels d’action3. Des études antérieures ont confirmé que la génération de potentiels d’action dans les cardiomyocytes est causée par le changement de la concentration d’ions intracellulaires, et l’activation et l’inactivation des canaux ioniques Na+, Ca2+ et K+ dans les cardiomyocytes humains conduisent à la formation de potentiels d’action dans une certaine séquence 4,5,6. Les courants perturbés des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) (IKv) pourraient modifier le rythme cardiaque normal, entraînant des arythmies, qui sont l’une des principales causes de décès. Par conséquent, l’enregistrement de l’IKv est essentiel pour comprendre les mécanismes des médicaments pour traiter les arythmies potentiellement mortelles7.

Le canal Kv est un composant important du canal potassique. La fonction de coordination du canal Kv joue un rôle important dans l’activité électrique et la contractilité myocardique du cœur des mammifères 8,9,10. Dans les cardiomyocytes, l’amplitude et la durée des potentiels d’action dépendent de la co-conduction des courants K+ sortants par plusieurs sous-types de canaux Kv11. La régulation de la fonction du canal Kv est très importante pour la repolarisation normale du potentiel d’action cardiaque. Même le moindre changement de conductance Kv a un impact considérable sur la repolarisation cardiaque et augmente la possibilité d’arythmie12,13.

Représentant une méthode fondamentale dans la recherche électrophysiologique cellulaire, un joint à haute résistance entre une petite zone de la membrane cellulaire et une pointe de pipette pour l’enregistrement de patch-clamp à cellules entières peut être établi en appliquant une pression négative. La pression négative continue fait que la membrane cellulaire entre en contact avec l’embout de la pipette et colle à la paroi interne de la pipette. Le circuit électrique complet résultant permet d’enregistrer n’importe quel courant de canal ionique unique à travers la surface de la membrane cellulaire14. Cette technique a une très grande sensibilité pour le courant du canal ionique de la membrane cellulaire et peut être utilisée pour détecter des courants dans tous les canaux ioniques, et les applications sont extrêmement larges15. De plus, par rapport au marquage fluorescent et au marquage radioactif, le patch-clamp a une autorité et une précision plus élevées16. À l’heure actuelle, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour détecter les composants de la médecine traditionnelle chinoise agissant sur les courants du canal Kv17,18,19. Par exemple, Wang et al. ont utilisé la technique du patch-clamp à cellules entières et ont confirmé que le composant efficace de la graine de lotus pourrait atteindre l’inhibition du canal Kv4.3 en bloquant les canaux d’étatactivés 19. L’aconitine (AC) est l’un des ingrédients efficaces et actifs des espèces d’Aconitum, telles que Aconitum carmichaeli Debx et Aconitum pendulum Busch. De nombreuses études ont montré que les surdoses de CA peuvent provoquer des arythmies et même un arrêt cardiaque20. L’interaction entre l’AC et les canaux ioniques voltage-dépendants conduit à la perturbation de l’homéostasie ionique intracellulaire, qui est le mécanisme clé de la cardiotoxicité21. Par conséquent, dans cette étude, la technique de patch-clamp à cellules entières est utilisée pour déterminer les effets de l’AC sur le IKv des cardiomyocytes.

Protocol

Les cardiomyocytes H9c2 de rat obtenus commercialement (voir le tableau des matières) ont été incubés dans du DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. La technique de patch-clamp à cellules entières a ensuite été utilisée pour détecter les changements dans IKv dans les cellules H9c2 normales et les cellules traitées 4-AP- ou AC (Figure <strong cl…

Representative Results

Ce protocole a permis l’enregistrement du IKv selon les paramètres définis dans la technique du patch-clamp à cellules entières. Le IKv a été déclenché par 150 ms de stimulus d’impulsion dépolarisant de −40 à +60 mV à un potentiel de maintien de −60 mV (Figure 3A). Le IKv des cardiomyocytes H9c2 du rat est d’abord apparu autour de -20 mV, puis l’amplitude a augmenté avec la dépolarisation. La relation moyenne entre le IKv e…

Discussion

La technique électrophysiologique patch-clamp est principalement utilisée pour enregistrer et refléter l’activité électrique et les caractéristiques fonctionnelles des canaux ioniques sur la membrane cellulaire25. À l’heure actuelle, les principales méthodes d’enregistrement de la technique patch-clamp comprennent l’enregistrement monocanal et l’enregistrement de cellules entières26. Pour le mode cellule entière, la microélectrode de verre et la pressio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous apprécions le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82130113) et du programme clé de R&D et de transformation du Département des sciences et de la technologie de la province du Qinghai (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
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References

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Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
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Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
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