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Registro de Corrente de Potássio Dependente de Voltagem em Cardiomiócitos H9c2 através da Técnica de Patch-Clamp de Células Inteiras

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

O presente protocolo descreve um método eficiente para a aquisição dinâmica e em tempo real de correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) em cardiomiócitos H9c2 usando a técnica de patch-clamp de células inteiras.

Abstract

Os canais de potássio na membrana celular miocárdica desempenham um papel importante na regulação das atividades eletrofisiológicas celulares. Sendo um dos principais canais iônicos, os canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) estão intimamente associados a algumas doenças cardíacas graves, como dano miocárdico induzido por drogas e infarto do miocárdio. No presente estudo, a técnica de patch-clamp de células inteiras foi empregada para determinar os efeitos de 1,5 mM de 4-aminopiridina (4-AP, um inibidor do canal de potássio de amplo espectro) e aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM e 200 μM) sobre a corrente do canal de Kv (IKv) em cardiomiócitos H9c2. Verificou-se que o 4-AP inibiu o I Kv em cerca de 54%, enquanto o efeito inibitório da CA sobre o IKv mostrou uma tendência dose-dependente (sem efeito para 25 μM, taxa inibitória de 30% para 50 μM, taxa inibitória de 46% para 100 μM e taxa inibitória de 54% para 200 μM). Devido às características de maior sensibilidade e precisão, esta técnica promoverá a exploração da cardiotoxicidade e dos efeitos farmacológicos da etnomedicina visando os canais iônicos.

Introduction

Os canais iônicos são proteínas especiais integradas embutidas na bicamada lipídica da membrana celular. Na presença de ativadores, os centros dessas proteínas especiais integradas formam poros hidrofílicos altamente seletivos, permitindo que íons de tamanho e carga apropriados passem de forma passivade transporte 1. Os canais iônicos são a base da excitabilidade celular e da bioeletricidade e desempenham um papel fundamental em uma variedade de atividades celulares2. O coração fornece sangue a outros órgãos através de contrações regulares resultantes de um processo acoplado à excitação-contração iniciado pelos potenciais de ação3. Estudos prévios confirmaram que a geração de potenciais de ação em cardiomiócitos é causada pela alteração da concentração de íons intracelulares, e a ativação e inativação dos canais iônicos Na+, Ca2+ e K+ em cardiomiócitos humanos levam à formação de potenciais de ação em uma determinada sequência 4,5,6. Correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) perturbadas (IKv) podem alterar o ritmo cardíaco normal, levando a arritmias, que são uma das principais causas de morte. Portanto, o registro do IKv é fundamental para a compreensão dos mecanismos das drogas para o tratamento de arritmias com risco de vida7.

O canal de Kv é um componente importante do canal de potássio. A função de coordenação do canal de Kv desempenha um papel importante na atividade elétrica e na contratilidade miocárdica do coração de mamíferos 8,9,10. Nos cardiomiócitos, a amplitude e a duração dos potenciais de ação dependem da cocondução de correntes K+ externas por múltiplos subtipos de canais de Kv11. A regulação da função do canal de Kv é muito importante para a repolarização normal do potencial de ação cardíaco. Mesmo a menor alteração na condutância de Kv impacta sobremaneira a repolarização cardíaca e aumenta a possibilidade de arritmia12,13.

Representando um método fundamental na pesquisa eletrofisiológica celular, uma vedação de alta resistência entre uma pequena área da membrana celular e uma ponta de pipeta para gravação de patch clamp de célula inteira pode ser estabelecida aplicando uma pressão negativa. A pressão negativa contínua faz com que a membrana celular entre em contato com a ponta da pipeta e grude na parede interna da pipeta. O circuito elétrico completo resultante permite registrar qualquer corrente de canal iônico único através da superfície da membrana celular14. Esta técnica tem uma sensibilidade muito alta para a corrente do canal iônico da membrana celular e pode ser usada para detectar correntes em todos os canais iônicos, e as aplicações são extremamente amplas15. Além disso, em comparação com a marcação fluorescente e a marcação radioativa, o patch-clamp tem maior autoridade e precisão16. Atualmente, a técnica de patch-clamp de células inteiras tem sido utilizada para detectar os componentes da medicina tradicional chinesa que atuam sobre as correntes do canal Kv17,18,19. Por exemplo, Wang et al. usaram a técnica de pinça de pinça de célula inteira e confirmaram que o componente efetivo da semente de lótus poderia alcançar a inibição do canal Kv4.3 bloqueando os canais de estado ativados19. A aconitina (AC) é um dos ingredientes eficazes e ativos das espécies de Acconitum, como Aconitum carmichaeli Debx e Aconitum pendulum Busch. Numerosos estudos têm demonstrado que overdoses de CA podem causar arritmias e até parada cardíaca20. A interação entre CA e canais iônicos dependentes de voltagem leva à ruptura da homeostase iônica intracelular, que é o principal mecanismo de cardiotoxicidade21. Portanto, neste estudo, a técnica de patch-clamp de células inteiras é usada para determinar os efeitos da CA no IKv dos cardiomiócitos.

Protocol

Os cardiomiócitos de ratos H9c2 obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) foram incubados em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%. A técnica de patch-clamp de células inteiras foi então empregada para detectar as alterações no IKv em células H9c2 normais e células tratadas com 4-AP- ou AC (Figura 1 e Figura…

Representative Results

Este protocolo permitiu o registro do IKv de acordo com os parâmetros estabelecidos na técnica patch-clamp de células inteiras. O IKv foi desencadeado por 150 ms de estímulo de pulso despolarizante de -40 a +60 mV a um potencial de retenção de -60 mV (Figura 3A). O IKv dos cardiomiócitos de ratos H9c2 apareceu pela primeira vez em torno de -20 mV e, em seguida, a amplitude aumentou com mais despolarização. A relação média entre o IKv e …

Discussion

A técnica eletrofisiológica patch-clamp é utilizada principalmente para registrar e refletir a atividade elétrica e as características funcionais dos canais iônicos na membrana celular25. Atualmente, os principais métodos de gravação da técnica patch-clamp incluem a gravação de canal único e a gravação de célula inteira26. Para o modo de célula inteira, o microeletrodo de vidro e a pressão negativa são usados para formar uma vedação de alta resistência…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130113) e do Programa Chave de P&D e Transformação do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Qinghai (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
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Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
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Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
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