JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten via de whole-cell patchklemtechniek

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Het huidige protocol beschrijft een efficiënte methode voor de real-time en dynamische acquisitie van voltage-gated kalium (Kv) kanaalstromen in H9c2 cardiomyocyten met behulp van de whole-cell patch-clamp techniek.

Abstract

Kaliumkanalen op het myocardiale celmembraan spelen een belangrijke rol bij de regulatie van celelektrofysiologische activiteiten. Omdat het een van de belangrijkste ionkanalen is, zijn voltage-gated kalium (Kv) -kanalen nauw verbonden met sommige ernstige hartaandoeningen, zoals door geneesmiddelen geïnduceerde myocardiale schade en een hartinfarct. In deze studie werd de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van 1,5 mM 4-aminopyridine (4-AP, een breedspectrum kaliumkanaalremmer) en aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM en 200 μM) op de Kv-kanaalstroom (IKv) in H9c2-cardiomyocyten te bepalen. Het bleek dat 4-AP de IKv met ongeveer 54% remde, terwijl het remmende effect van AC op de IKv een dosisafhankelijke trend vertoonde (geen effect voor 25 μM, 30% remmend tarief voor 50 μM, 46% remmend tarief voor 100 μM en 54% remmend tarief voor 200 μM). Vanwege de kenmerken van hogere gevoeligheid en precisie, zal deze techniek de verkenning van cardiotoxiciteit en de farmacologische effecten van etnomedicine gericht op ionkanalen bevorderen.

Introduction

Ionkanalen zijn speciale geïntegreerde eiwitten ingebed in de lipide bilayer van het celmembraan. In aanwezigheid van activatoren vormen de centra van dergelijke speciale geïntegreerde eiwitten zeer selectieve hydrofiele poriën, waardoor ionen van de juiste grootte en lading op een passieve transportmanier kunnen passeren1. Ionkanalen vormen de basis van celexcitabiliteit en bio-elektriciteit en spelen een sleutelrol in een verscheidenheid aan cellulaire activiteiten2. Het hart levert bloed aan andere organen door regelmatige samentrekkingen als gevolg van een excitatie-contractie-gekoppeld proces geïnitieerd door actiepotentialen3. Eerdere studies hebben bevestigd dat het genereren van actiepotentialen in cardiomyocyten wordt veroorzaakt door de verandering in intracellulaire ionenconcentratie, en de activering en inactivatie van Na+, Ca2+ en K+ ionkanalen in menselijke cardiomyocyten leiden tot de vorming van actiepotentialen in een bepaaldevolgorde 4,5,6. Verstoorde spanningsafhankelijke kalium (Kv) kanaalstromen (IKv) kunnen het normale hartritme veranderen, wat leidt tot aritmieën, die een van de belangrijkste doodsoorzaken zijn. Daarom is het opnemen van de IKv van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van geneesmiddelen voor de behandeling van levensbedreigende aritmieën7.

Het Kv-kanaal is een belangrijk onderdeel van het kaliumkanaal. De coördinatiefunctie van het Kv-kanaal speelt een belangrijke rol in de elektrische activiteit en myocardiale contractiliteit van het zoogdierhart 8,9,10. Bij cardiomyocyten zijn de amplitude en de duur van de actiepotentialen afhankelijk van de cogeleiding van uitgaande K+-stromen door meerdere Kv-kanaalsubtypen11. De regulatie van de Kv-kanaalfunctie is erg belangrijk voor de normale repolarisatie van het cardiale actiepotentiaal. Zelfs de kleinste verandering in Kv-geleiding heeft een grote invloed op cardiale repolarisatie en verhoogt de kans op aritmie12,13.

Vertegenwoordigend een fundamentele methode in cellulair elektrofysiologisch onderzoek, kan een hoge weerstandsafdichting tussen een klein deel van het celmembraan en een pipetpunt voor de registratie van de hele cel patchklem worden vastgesteld door een negatieve druk toe te passen. De continue onderdruk zorgt ervoor dat het celmembraan in contact komt met de pipetpunt en op de binnenwand van de pipet blijft plakken. Het resulterende volledige elektrische circuit maakt het mogelijk om elke enkele ionkanaalstroom over het oppervlak van het celmembraan te registreren14. Deze techniek heeft een zeer hoge gevoeligheid voor de ionkanaalstroom van het celmembraan en kan worden gebruikt om stromen in alle ionkanalen te detecteren, en de toepassingen zijn extreem breed15. Bovendien heeft patch-clamp, in vergelijking met fluorescerende etikettering en radioactieve etikettering, een hogere autoriteit en nauwkeurigheid16. Op dit moment is de whole-cell patch-clamp-techniek gebruikt om de traditionele Chinese medicijncomponenten te detecteren die werken op Kv-kanaalstromen 17,18,19. Wang et al. gebruikten bijvoorbeeld de whole-cell patch-clamp-techniek en bevestigden dat de effectieve component van het lotuszaad de remming van het Kv4.3-kanaal zou kunnen bereiken door de geactiveerde toestandskanalen19 te blokkeren. Aconitine (AC) is een van de effectieve en actieve ingrediënten van Aconitum-soorten, zoals Aconitum carmichaeli Debx en Aconitum pendelbusch. Talrijke studies hebben aangetoond dat overdoses van AC aritmieën en zelfs hartstilstand kunnen veroorzaken20. De interactie tussen AC- en spanningsafhankelijke ionkanalen leidt tot de verstoring van intracellulaire ionhomeostase, het belangrijkste mechanisme van cardiotoxiciteit21. Daarom wordt in deze studie de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van AC op de IKv van cardiomyocyten te bepalen.

Protocol

De commercieel verkregen H9c2 rat cardiomyocyten (zie de tabel van materialen) werden geïncubeerd in DMEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer. De whole-cell patch-clamp techniek werd vervolgens gebruikt om de veranderingen in IKv in normale H9c2 cellen en 4-AP- of AC-behandelde cellen te detecteren (figuur 1 en figuur 2)….

Representative Results

Dit protocol maakte de opname van de IKv mogelijk volgens de parameters die zijn ingesteld in de hele-cel patch-clamp techniek. De IKv werd geactiveerd door 150 ms depolariserende pulsstimulus van −40 tot +60 mV bij een houdpotentiaal van −60 mV (figuur 3A). De IKv van de H9c2 rat cardiomyocyten verscheen eerst rond -20 mV, en daarna nam de amplitude toe met verdere depolarisatie. De gemiddelde relatie tussen de IKv en de membraanpotentiaal wer…

Discussion

De patch-clamp elektrofysiologische techniek wordt voornamelijk gebruikt om de elektrische activiteit en functionele kenmerken van ionkanalen op het celmembraan te registreren en weer te geven25. Op dit moment omvatten de belangrijkste opnamemethoden van de patch-clamp-techniek eenkanaalsopname en hele celopname26. Voor de hele celmodus worden de glasmicro-elektrode en negatieve druk gebruikt om een zeer resistente afdichting te vormen tussen een klein deel van het celmembr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We waarderen de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (82130113) en het Key R &D and Transformation Program van de afdeling Wetenschap & Technologie van de provincie Qinghai (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
check_url/kr/64805?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image