JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği ile H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Bu protokol, tüm hücre yama kelepçesi tekniğini kullanarak H9c2 kardiyomiyositlerinde voltaj kapılı potasyum (Kv) kanal akımlarının gerçek zamanlı ve dinamik olarak elde edilmesi için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

Abstract

Miyokard hücre zarı üzerindeki potasyum kanalları, hücre elektrofizyolojik aktivitelerinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ana iyon kanallarından biri olan voltaj kapılı potasyum (Kv) kanalları, ilaca bağlı miyokard hasarı ve miyokard enfarktüsü gibi bazı ciddi kalp hastalıkları ile yakından ilişkilidir. Bu çalışmada, H9c2 kardiyomiyositlerinde 1.5 mM 4-aminopiridin (4-AP, geniş spektrumlu potasyum kanal inhibitörü) ve akonitinin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM ve 200 μM) Kv kanal akımı (IKv) üzerindeki etkilerini belirlemek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılmıştır. 4-AP’nin IKv’yi yaklaşık% 54 oranında inhibe ettiği, AC’nin I Kv üzerindeki inhibitör etkisinin doza bağımlı bir eğilim gösterdiği bulunmuştur (25μM için etki yok, 50 μM için% 30 inhibitör oran, 100 μM için% 46 inhibitör oranı ve 200 μM için% 54 inhibitör oranı). Daha yüksek duyarlılık ve hassasiyet özellikleri nedeniyle, bu teknik kardiyotoksisitenin araştırılmasını ve etnotıbbın iyon kanallarını hedeflemesinin farmakolojik etkilerini teşvik edecektir.

Introduction

İyon kanalları, hücre zarının lipit çift katmanına gömülü özel entegre proteinlerdir. Aktivatörlerin varlığında, bu tür özel entegre proteinlerin merkezleri, uygun boyut ve yükteki iyonların pasif bir taşıma yöntemiyle geçmesine izin veren oldukça seçici hidrofilik gözenekler oluşturur1. İyon kanalları, hücre uyarılabilirliğinin ve biyoelektriğin temelidir ve çeşitli hücresel aktivitelerde önemli bir rol oynar2. Kalp, aksiyon potansiyelleri tarafından başlatılan uyarılma-kasılma-birleşmiş bir süreçten kaynaklanan düzenli kasılmalar yoluyla diğer organlara kan sağlar3. Önceki çalışmalar, kardiyomiyositlerde aksiyon potansiyellerinin oluşumunun hücre içi iyon konsantrasyonundaki değişimden kaynaklandığını ve insan kardiyomiyositlerinde Na +, Ca2 + ve K + iyon kanallarının aktivasyonu ve inaktivasyonunun belirli bir sırayla aksiyon potansiyellerinin oluşumuna yol açtığını doğrulamıştır 4,5,6. Bozulmuş voltaj kapılı potasyum (Kv) kanal akımları (IKv) normal kalp ritmini değiştirebilir ve önde gelen ölüm nedenlerinden biri olan aritmilere yol açabilir. Bu nedenle, IKv’nin kaydedilmesi, hayatı tehdit eden aritmilerin tedavisinde kullanılan ilaçların mekanizmalarını anlamak için kritik önemesahiptir 7.

Kv kanalı, potasyum kanalının önemli bir bileşenidir. Kv kanalının koordinasyon fonksiyonu, memeli kalbinin elektriksel aktivitesinde ve miyokard kontraktilitesinde önemli bir rol oynar 8,9,10. Kardiyomiyositlerde, aksiyon potansiyellerinin genliği ve süresi, dışa doğru K + akımlarının çoklu Kv kanalı alt tipleri11 tarafından birlikte iletilmesine bağlıdır. Kv kanal fonksiyonunun düzenlenmesi, kardiyak aksiyon potansiyelinin normal repolarizasyonu için çok önemlidir. Kv iletkenliğindeki en ufak bir değişiklik bile kardiyak repolarizasyonu büyük ölçüde etkiler ve aritmi olasılığını arttırır12,13.

Hücresel elektrofizyolojik araştırmalarda temel bir yöntemi temsil eden hücre zarının küçük bir alanı ile tüm hücre yama-kelepçe kaydı için pipet ucu arasında negatif basınç uygulanarak yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulabilir. Sürekli negatif basınç, hücre zarının pipet ucuyla temas etmesini ve pipetin iç duvarına yapışmasını sağlar. Ortaya çıkan tam elektrik devresi, hücre zarı14’ün yüzeyi boyunca herhangi bir tek iyon kanalı akımının kaydedilmesini sağlar. Bu teknik, hücre zarı iyon kanalı akımı için çok yüksek bir hassasiyete sahiptir ve tüm iyon kanallarındaki akımları tespit etmek için kullanılabilir ve uygulamalar son derece geniştir15. Ayrıca, floresan etiketleme ve radyoaktif etiketleme ile karşılaştırıldığında, yama kelepçesi daha yüksek otorite ve doğruluğa sahiptir16. Şu anda, tüm hücre yama-kelepçe tekniği, Kv kanal akımlarına etki eden geleneksel Çin tıbbı bileşenlerini tespit etmek için kullanılmıştır17,18,19. Örneğin, Wang ve ark. tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullandılar ve lotus tohumunun etkili bileşeninin, aktif durum kanallarını bloke ederek Kv4.3 kanalının inhibisyonunu sağlayabileceğini doğruladılar19. Aconitine (AC), Aconitum carmichaeli Debx ve Aconitum sarkaç Busch gibi Aconitum türlerinin etkili ve aktif bileşenlerinden biridir. Çok sayıda çalışma, aşırı dozda AC’nin aritmilere ve hatta kalp durmasına neden olabileceğini göstermiştir20. AC ve voltaj kapılı iyon kanalları arasındaki etkileşim, kardiyotoksisitenin anahtar mekanizması olan hücre içi iyon homeostazının bozulmasına yol açar21. Bu nedenle, bu çalışmada, AC’nin kardiyomiyositlerin IKv’si üzerindeki etkilerini belirlemek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılmıştır.

Protocol

Ticari olarak elde edilen H9c2 sıçan kardiyomiyositleri ( Malzeme Tablosuna bakınız), %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C’de ısıl inaktive fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin içeren DMEM’de inkübe edildi. Daha sonra normal H9c2 hücrelerinde ve 4-AP veya AC ile tedavi edilen hücrelerde IKv’deki değişiklikleri tespit etmek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanıldı (Şekil 1 ve …

Representative Results

Bu protokol, IKv’nin tüm hücre yama-kelepçe tekniğinde ayarlanan parametrelere göre kaydedilmesine izin verdi. IKv, -60 mV’luk bir tutma potansiyelinde -40 ila +60 mV’luk bir depolarizan darbe uyaranı ile 150 ms depolarizan darbe uyaranı ile tetiklendi (Şekil 3A). H9c2 sıçan kardiyomiyositlerinin IKv’si ilk önce -20 mV civarında ortaya çıktı ve daha sonra genlik daha fazla depolarizasyon ile arttı. IKv ve membran potansiyeli arasın…

Discussion

Yama-kelepçe elektrofizyolojik tekniği esas olarak hücre zarı25 üzerindeki iyon kanallarının elektriksel aktivitesini ve fonksiyonel özelliklerini kaydetmek ve yansıtmak için kullanılır. Şu anda, yama kelepçe tekniğinin ana kayıt yöntemleri arasında tek kanallı kayıt ve tüm hücre kaydı26 bulunmaktadır. Tüm hücre modu için, cam mikroelektrot ve negatif basınç, hücre zarının küçük bir alanı ile pipet ucu27 arasında …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’nın (82130113) ve Qinghai Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanının Anahtar Ar-Ge ve Dönüşüm Programı’nın (2020-SF-C33) finansal desteğini takdir ediyoruz.

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
check_url/kr/64805?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image