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의학

Spannungsabhängige Kaliumstromaufzeichnung an H9C2-Kardiomyozyten mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Technik

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Echtzeit- und dynamischen Erfassung von spannungsgesteuerten Kaliumkanalströmen (Kv) in H9c2-Kardiomyozyten unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik.

Abstract

Kaliumkanäle auf der myokardialen Zellmembran spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der elektrophysiologischen Aktivitäten der Zellen. Als einer der wichtigsten Ionenkanäle sind spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (Kv) eng mit einigen schweren Herzerkrankungen wie medikamenteninduzierten Myokardschäden und Myokardinfarkt verbunden. In der vorliegenden Studie wurde die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Wirkungen von 1,5 mM 4-Aminopyridin (4-AP, ein Breitband-Kaliumkanalinhibitor) und Aconitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM und 200 μM) auf den Kv-Kanalstrom (IKv) in H9c2-Kardiomyozyten zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass 4-AP das I Kv um etwa 54% hemmte, während die hemmende Wirkung von AC auf das IKv einen dosisabhängigen Trend zeigte (keine Wirkung für 25 μM, 30% Hemmrate für 50 μM, 46% Hemmrate für 100 μM und 54% Hemmrate für 200 μM). Aufgrund der Eigenschaften einer höheren Empfindlichkeit und Präzision wird diese Technik die Erforschung der Kardiotoxizität und der pharmakologischen Wirkungen der Ethnomedizin auf Ionenkanäle fördern.

Introduction

Ionenkanäle sind spezielle integrierte Proteine, die in die Lipiddoppelschicht der Zellmembran eingebettet sind. In Gegenwart von Aktivatoren bilden die Zentren solcher speziellen integrierten Proteine hochselektive hydrophile Poren, die Ionen geeigneter Größe und Ladung passiv transportieren1. Ionenkanäle sind die Grundlage der Zellerregbarkeit und Bioelektrizität und spielen eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von zellulären Aktivitäten2. Das Herz versorgt andere Organe durch regelmäßige Kontraktionen mit Blut, die aus einem Erregungs-Kontraktions-gekoppelten Prozess resultieren, der durch Aktionspotentiale ausgelöstwird 3. Frühere Studien haben bestätigt, dass die Erzeugung von Aktionspotentialen in Kardiomyozyten durch die Änderung der intrazellulären Ionenkonzentration verursacht wird, und die Aktivierung und Inaktivierung von Na+, Ca2+ und K + Ionenkanälen in menschlichen Kardiomyozyten führt zur Bildung von Aktionspotentialen in einer bestimmten Sequenz 4,5,6. Gestörte spannungsabhängige Kalium (Kv) Kanalströme (IKv) können den normalen Herzrhythmus verändern und zu Arrhythmien führen, die eine der häufigsten Todesursachen sind. Daher ist die Erfassung des IKv entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von Medikamenten zur Behandlung lebensbedrohlicher Arrhythmien7.

Der Kv-Kanal ist ein wichtiger Bestandteil des Kaliumkanals. Die Koordinationsfunktion des Kv-Kanals spielt eine wichtige Rolle bei der elektrischen Aktivität und myokardialen Kontraktilität des Säugetierherzens 8,9,10. In Kardiomyozyten hängen Amplitude und Dauer der Aktionspotentiale von der Koleitung von nach außen gerichteten K+-Strömen durch mehrere Kv-Kanal-Subtypen11 ab. Die Regulation der Kv-Kanalfunktion ist sehr wichtig für die normale Repolarisation des kardialen Aktionspotentials. Schon die geringste Änderung der Kv-Leitfähigkeit wirkt sich stark auf die kardiale Repolarisation aus und erhöht die Möglichkeit einer Arrhythmie12,13.

Als grundlegende Methode in der zellulären elektrophysiologischen Forschung kann durch Anlegen eines Unterdrucks eine hochohmige Abdichtung zwischen einem kleinen Bereich der Zellmembran und einer Pipettenspitze für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung hergestellt werden. Durch den kontinuierlichen Unterdruck kommt die Zellmembran mit der Pipettenspitze in Kontakt und haftet an der Innenwand der Pipette. Der resultierende vollständige elektrische Schaltkreis ermöglicht es, jeden einzelnen Ionenkanalstrom über die Oberfläche der Zellmembran14 aufzuzeichnen. Diese Technik hat eine sehr hohe Empfindlichkeit für den Ionenkanalstrom der Zellmembran und kann verwendet werden, um Ströme in allen Ionenkanälen zu detektieren, und die Anwendungen sind extrem breit15. Darüber hinaus hat Patch-Clamp im Vergleich zur fluoreszierenden Markierung und radioaktiven Markierung eine höhere Autorität und Genauigkeit16. Gegenwärtig wird die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Komponenten der traditionellen chinesischen Medizin nachzuweisen, die auf Kv-Kanalströme17,18,19 wirken. Zum Beispiel verwendeten Wang et al. die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik und bestätigten, dass die effektive Komponente des Lotussamens die Hemmung des Kv4.3-Kanals erreichen könnte, indem sie die aktivierten Zustandskanäleblockiert 19. Aconitin (AC) ist einer der wirksamen und aktiven Inhaltsstoffe von Aconitum-Arten, wie Aconitum carmichaeli Debx und Aconitum pendulum Busch. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Überdosierungen von AC Arrhythmien und sogar Herzstillstand verursachen können20. Die Wechselwirkung zwischen AC- und spannungsabhängigen Ionenkanälen führt zur Störung der intrazellulären Ionenhomöostase, die der Schlüsselmechanismus der Kardiotoxizität ist21. Daher wird in dieser Studie die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Auswirkungen von AC auf das IKv von Kardiomyozyten zu bestimmen.

Protocol

Die kommerziell gewonnenen H9c2-Kardiomyozyten der Ratte (siehe Materialtabelle) wurden in DMEM inkubiert, das 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einer mit 5%CO2 befeuchteten Atmosphäre enthielt. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik wurde dann verwendet, um die Veränderungen in IKv in normalen H9c2-Zellen und 4-AP- oder AC-behandelten Zellen zu erkennen (Abbildung 1 und Abbild…

Representative Results

Dieses Protokoll ermöglichte die Aufzeichnung des IKv gemäß den Parametern, die in der Ganzzellen-Patch-Clamp-Technik eingestellt wurden. Das IKv wurde durch 150 ms depolarisierenden Pulsstimulus von −40 bis +60 mV bei einem Haltepotential von −60 mV ausgelöst (Abbildung 3A). Das IKv der H9c2-Kardiomyozyten der Ratte erschien zuerst um −20 mV, und dann nahm die Amplitude mit weiterer Depolarisation zu. Aus den gemessenen Stromamplituden wurde die mi…

Discussion

Die elektrophysiologische Patch-Clamp-Technik wird hauptsächlich verwendet, um die elektrische Aktivität und funktionelle Eigenschaften von Ionenkanälen auf der Zellmembran25 aufzuzeichnen und zu reflektieren. Gegenwärtig umfassen die Hauptaufzeichnungsverfahren der Patch-Clamp-Technik die Einkanalaufzeichnung und die Ganzzellenaufzeichnung26. Für den Ganzzellenmodus werden die Glasmikroelektrode und der Unterdruck verwendet, um eine hochohmige Abdichtung zwischen eine…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir freuen uns über die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Foundation of China (82130113) und des Key R&D and Transformation Program der Science & Technology Department der Provinz Qinghai (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
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Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
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Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
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