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의학

Registro de corriente de potasio dependiente del voltaje en cardiomiocitos H9c2 mediante la técnica de pinza de parche de células enteras

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

El presente protocolo describe un método eficiente para la adquisición dinámica y en tiempo real de corrientes de canal de potasio (Kv) dependientes de voltaje en cardiomiocitos H9c2 utilizando la técnica de pinza de parche de células enteras.

Abstract

Los canales de potasio en la membrana celular miocárdica juegan un papel importante en la regulación de las actividades electrofisiológicas celulares. Al ser uno de los principales canales iónicos, los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) están estrechamente asociados con algunas enfermedades cardíacas graves, como el daño miocárdico inducido por medicamentos y el infarto de miocardio. En el presente estudio, se empleó la técnica de patch-clamp de células enteras para determinar los efectos de 1,5 mM 4-aminopiridina (4-AP, un inhibidor de los canales de potasio de amplio espectro) y aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM y 200 μM) sobre la corriente del canal Kv (IKv) en cardiomiocitos H9c2. Se encontró que la 4-AP inhibió el I Kv en aproximadamente un 54%, mientras que el efecto inhibitorio de la CA sobre el IKv mostró una tendencia dependiente de la dosis (ningún efecto para 25 μM, tasa inhibitoria del 30% para 50 μM, tasa inhibitoria del 46% para 100 μM y tasa inhibitoria del 54% para 200 μM). Debido a las características de mayor sensibilidad y precisión, esta técnica promoverá la exploración de la cardiotoxicidad y los efectos farmacológicos de la etnomedicina dirigida a los canales iónicos.

Introduction

Los canales iónicos son proteínas integradas especiales incrustadas en la bicapa lipídica de la membrana celular. En presencia de activadores, los centros de tales proteínas integradas especiales forman poros hidrófilos altamente selectivos, permitiendo que iones de un tamaño y carga apropiados pasen a través de una manera de transporte pasivo1. Los canales iónicos son la base de la excitabilidad celular y la bioelectricidad y desempeñan un papel clave en una variedad de actividades celulares2. El corazón suministra sangre a otros órganos a través de contracciones regulares resultantes de un proceso acoplado excitación-contracción iniciado por potenciales de acción3. Estudios previos han confirmado que la generación de potenciales de acción en los cardiomiocitos es causada por el cambio en la concentración de iones intracelulares, y la activación e inactivación de los canales iónicos Na+, Ca2+ y K+ en los cardiomiocitos humanos conducen a la formación de potenciales de acción en una cierta secuencia 4,5,6. Las corrientes alteradas del canal de potasio (Kv) dependientes de voltaje (IKv) podrían cambiar el ritmo cardíaco normal, lo que lleva a arritmias, que son una de las principales causas de muerte. Por lo tanto, el registro del IKv es crítico para comprender los mecanismos de los fármacos para el tratamiento de arritmias potencialmente mortales7.

El canal Kv es un componente importante del canal de potasio. La función de coordinación del canal Kv juega un papel importante en la actividad eléctrica y la contractilidad miocárdica del corazón de los mamíferos 8,9,10. En los cardiomiocitos, la amplitud y la duración de los potenciales de acción dependen de la coconducción de las corrientes K+ hacia el exterior por múltiples subtipos de canales Kv11. La regulación de la función del canal Kv es muy importante para la repolarización normal del potencial de acción cardíaco. Incluso el más mínimo cambio en la conductancia del Kv afecta en gran medida la repolarización cardíaca y aumenta la posibilidad de arritmia12,13.

Representando un método fundamental en la investigación electrofisiológica celular, se puede establecer un sello de alta resistencia entre un área pequeña de la membrana celular y una punta de pipeta para el registro de pinza de parche de células enteras aplicando una presión negativa. La presión negativa continua hace que la membrana celular entre en contacto con la punta de la pipeta y se adhiera a la pared interna de la pipeta. El circuito eléctrico completo resultante permite registrar cualquier corriente de canal iónico a través de la superficie de la membrana celular14. Esta técnica tiene una sensibilidad muy alta para la corriente del canal iónico de la membrana celular y se puede utilizar para detectar corrientes en todos los canales iónicos, y las aplicaciones son extremadamente amplias15. Además, en comparación con el etiquetado fluorescente y el etiquetado radiactivo, la pinza de parche tiene mayor autoridad y precisión16. En la actualidad, se ha utilizado la técnica de patch-clamp de células enteras para detectar los componentes de la medicina tradicional china que actúan sobre las corrientes del canal Kv17,18,19. Por ejemplo, Wang et al. utilizaron la técnica de patch-clamp de células enteras y confirmaron que el componente efectivo de la semilla de loto podría lograr la inhibición del canal Kv4.3 bloqueando los canales de estado activado19. La aconitina (AC) es uno de los ingredientes efectivos y activos de las especies de Aconitum, como Aconitum carmichaeli Debx y Aconitum pendulum Busch. Numerosos estudios han demostrado que las sobredosis de CA pueden causar arritmias e incluso paro cardíaco20. La interacción entre la CA y los canales iónicos dependientes de voltaje conduce a la interrupción de la homeostasis iónica intracelular, que es el mecanismo clave de la cardiotoxicidad21. Por lo tanto, en este estudio, se utiliza la técnica de patch-clamp de células enteras para determinar los efectos de AC en el IKv de los cardiomiocitos.

Protocol

Los cardiomiocitos de rata H9c2 obtenidos comercialmente (ver la Tabla de materiales) se incubaron en DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C en una atmósfera humidificada deCO2 al 5%. La técnica de patch-clamp de células enteras se empleó para detectar los cambios en IKv en células H9c2 normales y células tratadas con 4-AP o CA (Figura 1 y Figura 2</st…

Representative Results

Este protocolo permitió el registro del IKv de acuerdo con los parámetros establecidos en la técnica de patch-clamp de células enteras. El IKv fue activado por 150 ms de estímulo de pulso despolarizante de -40 a +60 mV a un potencial de retención de -60 mV (Figura 3A). El IKv de los cardiomiocitos de rata H9c2 apareció por primera vez alrededor de -20 mV, y luego la amplitud aumentó con una mayor despolarización. La relación media entre el IKv<…

Discussion

La técnica electrofisiológica patch-clamp se utiliza principalmente para registrar y reflejar la actividad eléctrica y las características funcionales de los canales iónicos en la membrana celular25. En la actualidad, los principales métodos de grabación de la técnica patch-clamp incluyen la grabación de un solo canal y la grabación de célulascompletas 26. Para el modo de celda completa, el microelectrodo de vidrio y la presión negativa se utilizan para formar u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82130113) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo y Transformación del Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Qinghai (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
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Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
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Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
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