Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das beschreibt, wie menschliche Ovarialfollikel aus gefrorenem und aufgetautem kortikalem Gewebe isoliert werden können, um Genexpressionsanalysen durchzuführen.
Abstract
Der Eierstock ist ein heterogenes Organ, das sich aus verschiedenen Zelltypen zusammensetzt. Um die molekularen Mechanismen während der Follikulogenese zu untersuchen, kann die Lokalisierung von Proteinen und Genexpression auf fixiertem Gewebe durchgeführt werden. Um die Genexpression in einem menschlichen Follikel richtig beurteilen zu können, muss diese komplexe und empfindliche Struktur jedoch isoliert werden. Daher wurde ein angepasstes Protokoll entwickelt, das zuvor von Woodruffs Labor beschrieben wurde, um die Follikel (die Eizelle und die Granulosazellen) von ihrer Umgebung zu trennen. Das kortikale Gewebe der Eierstöcke wird zunächst manuell bearbeitet, um kleine Fragmente mit zwei Werkzeugen zu erhalten: einem Gewebeschneider und einem Gewebezerkleinerer. Das Gewebe wird dann mit 0,2 % Kollagenase und 0,02 % DNase für mindestens 40 min enzymatisch verdaut. Dieser Aufschlussschritt wird bei 37 °C und 5 % CO2 durchgeführt und von einem mechanischen Pipettieren des Mediums alle 10 min begleitet. Nach der Inkubation werden die isolierten Follikel manuell mit einer kalibrierten Mikrokapillarpipette unter mikroskopischer Vergrößerung entnommen. Wenn noch Follikel in den Gewebestücken vorhanden sind, wird der Eingriff mit einer manuellen Mikrodissektion abgeschlossen. Die Follikel werden auf Eis in einem Nährmedium gesammelt und zweimal in Tröpfchen phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Dieser Verdauungsvorgang muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine Verschlechterung der Follikel zu vermeiden. Sobald die Struktur der Follikel beeinträchtigt zu sein scheint oder nach maximal 90 Minuten, wird die Reaktion mit einer 4 °C heißen Blockierlösung gestoppt, die 10 % fötales Kälberserum enthält. Es sollten mindestens 20 isolierte Follikel (mit einer Größe unter 75 μm) entnommen werden, um nach der RNA-Extraktion eine ausreichende Menge an Gesamt-RNA für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RT-qPCR) zu erhalten. Nach der Extraktion erreicht die Quantifizierung der Gesamt-RNA aus 20 Follikeln einen Mittelwert von 5 ng/μL. Die gesamte RNA wird dann in cDNA retrotranskribiert und die interessierenden Gene werden mittels RT-qPCR weiter analysiert.
Introduction
Der Eierstock ist ein komplexes Organ, das aus funktionellen und strukturellen Einheiten besteht, einschließlich der Follikel innerhalb der Hirnrinde und des Stromas. Die Follikulogenese, der Prozess der Follikelaktivierung, des Wachstums und der Reifung von einem ursprünglichen Ruhezustand zu einem reifen Follikel, der befruchtet werden kann und die frühe Embryonalentwicklung unterstützt, wird in der Forschung umfassend untersucht1. Die Entschlüsselung der Mechanismen, die dieses Phänomen antreiben, könnte die Fruchtbarkeitsversorgung von Frauen verbessern2. Analysen an fixiertem menschlichem Gewebe ermöglichen die Beurteilung der Proteinexpression und der Genlokalisation innerhalb der funktionellen Einheiten des Ovars 3,4. Es sind jedoch spezielle Techniken erforderlich, um die Follikel von der umgebenden Hirnrinde zu trennen, um die Genexpression in den Eierstockfollikeln genau zu bestimmen. Daher wurde in einer früheren Studie eine Follikelisolationstechnik entwickelt, die Analysen der Genexpression direkt aus der funktionellen Einheit des Ovars ermöglicht5. Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, wie z. B. der enzymatische Aufschluss und/oder die mechanische Isolierung sowie die Laser-Capture-Mikrodissektion, die eine Follikelisolierung innerhalb eines Gewebestücks ermöglichen 6,7,8,9. Die Follikelisolierung wird häufig verwendet, entweder mit menschlichem oder tierischem Eierstockgewebe, um die Genexpressionsprofile von Follikeln in allen Entwicklungsstadien zu bewerten10,11,12. Ein optimales Isolationsverfahren sollte jedoch die fragile Struktur des Follikels innerhalb des dichten Kortex berücksichtigen und daher mit Sorgfalt durchgeführt werden, um Schäden zu vermeiden7. Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren, das von einem von Woodruffs Labor beschriebenen Protokoll adaptiert wurde, um menschliche Follikel aus gefrorener und aufgetauter Eierstockrinde zu isolieren, um Genexpressionsanalysen durchzuführen13.
Der erste Schritt der Isolierung der Eierstockfollikel aus gefrorenem menschlichem Gewebe ist das Auftauen. Dieser Prozess wird auf der Grundlage des klinischen Protokolls durchgeführt, das für die Transplantation von kryokonserviertem Eierstockgewebe verwendet wird, wie zuvor beschrieben14,15. Das Verfahren zielt darauf ab, die Kryoprotektiva zu entfernen, indem die Eierstockrinde in abnehmenden Konzentrationen des Mediums gespült wird. Anschließend wird das Gewebe fragmentiert, bevor es enzymatisch und mechanisch isoliert wird, um die Follikel zu gewinnen. Follikel in verschiedenen Stadien können mit einem Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung und hochwertiger Optik unterschieden werden, um die interessierenden Follikel zu isolieren. Jeder isolierte Follikel wird mit einem in das Mikroskop integrierten Lineal gemessen, und die Follikel können nach ihrem Entwicklungsstadium zusammengefasst werden: Primordialfollikel (30 μm), Primärfollikel (60 μm), Sekundärfollikel (120-200 μm) und Antralfollikel (>200 μm)16. Eine weitere Klassifizierung kann nach der Morphologie der Follikel vorgenommen werden: primordiale Follikel haben eine Schicht abgeflachter Granulosazellen (GCs), primäre Follikel haben eine Schicht quaderförmiger GCs, sekundäre Follikel haben mindestens zwei Schichten quaderförmiger GCs, und das Vorhandensein eines Hohlraums zwischen den GCs charakterisiert das Antralstadium. Wenn die interessierenden Follikel ausgewählt werden, wird eine RNA-Extraktion durchgeführt. Die RNA-Quantität und -Qualität wird vor der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) in Echtzeit bewertet (Abbildung 1).
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Protocol
Dieses Projekt wurde von der Ethikkommission des Erasme-Krankenhauses (Brüssel, Belgien) genehmigt. Die in dieses Protokoll eingeschlossene Patientin unterzog sich vor der Chemotherapie im Jahr 2000 einer Kryokonservierung des Eierstockgewebes (OTC) zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Die Patientin unterschrieb eine schriftliche Einverständniserklärung, ihr verbleibendes gefrorenes Gewebe am Ende der Aufbewahrungsfrist für die Forschung zu spenden.
1. Auftauen von kryokonserviertem Eierstockgewebe
- Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit fünf Auftaulösungen vor. Die erste Vertiefung enthält 5 ml Kryoprotektivlösung, bestehend aus Leibovitz-15-Medium, 0,1 mol/l Saccharose, 1,5 mol/l Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1 % humanem Serumalbumin (HSA). Die nächsten Vertiefungen enthalten 5 ml Leibovitz-15-Medium mit abnehmenden Konzentrationen des Kryoprotektionsmittels: 1 mol/l, 0,5 mol/l und 2 x 0 mol/l DMSO.
HINWEIS: Die Kryoprotektivlösung kann je nach Protokoll, das in der Fruchtbarkeitsklinik verwendet wird, unterschiedlich sein. - Entnehmen Sie eine Durchstechflasche mit einem kortikalen Fragment der Eierstöcke aus flüssigem Stickstoff unter Einhaltung der Sicherheitsvorschriften (Kryohandschuhe, Schutzbrille und geschlossene Schuhe) und bewahren Sie das Röhrchen 30 s lang bei Raumtemperatur (RT) auf.
- Weichen Sie das Fläschchen 2 Minuten lang bei RT unter leichtem Rühren in doppelt destilliertem Wasser ein, bevor Sie das Fläschchen unter einer vertikalen Haube öffnen und direkt in die erste Vertiefung der 6-Well-Platte (auf Eis) überführen.
- Das Fragment wird nacheinander in jede Vertiefung der 6-Well-Platte überführt, wobei jedes Fragment abnehmende Konzentrationen von Kryoprotektivum in 5 ml Leibovitz-15-Medium enthält. Bewegen Sie das Gewebe in jedem Medium 5 Minuten lang vorsichtig (auf Eis).
2. Isolierung der Follikel
HINWEIS: Alle Experimente werden mit RNase-freien Materialien und unter einer vertikalen Haube durchgeführt.
- Das aufgetaute Gewebe wird in eine 2 mm große, gerasterte Petrischale überführt, die mit 10 ml Präpariermedium (Leibovitz-15-Medium, Natriumpyruvat [2 mmol/l], L-Glutamin [2 mmol/l], HSA [0,3 %], Penicillin G [30 μg/ml] und Streptomycin [50 μg/ml]) gefüllt ist. Passen Sie die Größe des Gewebes bei Bedarf mit einem Skalpell an.
HINWEIS: Je nach klinischem Protokoll kann die Größe des gefrorenen Gewebes zwischen 8 mm x 4 mm x 1 mm und 4 mm x 2 mm x 1 mm variieren. Für dieses Protokoll wurden zwei Streifen von 4 mm x 2 mm x 1 mm verwendet. - Stapeln Sie die drei Teile des Gewebeschneiders, legen Sie das Fragment zwischen die beiden Blöcke und schneiden Sie das Fragment mit einer Klinge in zwei Hälften, indem Sie durch die Blöcke gleiten, um zwei Fragmente von 0,5 mm Dicke zu erhalten.
- Verwenden Sie den Gewebezerkleinerer, um das Fragment zu schneiden und kleinere Stücke zu erhalten. Schneiden Sie die restlichen Stücke bei Bedarf manuell mit einem Skalpell ab, bis das Gewebe vollständig zerbrochen ist.
- Übertragen Sie das fragmentierte Gewebe in eine gerasterte Petrischale, die mit 7 ml Verdauungsmedium gefüllt ist (Nährmedium [McCoy's 5A-Medium, 3 mmol/l Glutamin, 0,1 % HSA, 30 μg/ml Penicillin G, 50 μg/ml Streptomycin, 2,5 μg/ml Transferrin, 4 ng/ml Selen und 50 μg/ml Ascorbinsäure], ergänzt mit 0,2 % Kollagenase und 0,02 % DNase).
- Stellen Sie die Schale bei 5% CO2 und 37 °C in den Inkubator. Nehmen Sie alle 10 Minuten die Petrischale aus dem Inkubator und spülen Sie das Gewebe durch Auf- und Abpipettieren mit einer 1-ml-Pipette.
- Nach 45-minütiger Inkubation im Verdauungsmedium wird die Schale unter ein Stereomikroskop mit einem Vergrößerungsbereich von 5x-6,3x gestellt und die Follikel mit einer Mikrokapillarpipette entnommen. Wählen Sie die interessierenden Follikel aus und isolieren Sie sie, indem Sie sie mit einer Mundpipette aufsaugen.
Anmerkungen: Das Pipettieren mit dem Mund sollte vorsichtig durchgeführt werden, um Materialverlust in das Rohr und Verunreinigungen zu vermeiden. - Wenn die Follikel in einem Stück Kortex stecken bleiben, isolieren Sie sie mechanisch mit zwei 27-G-Spritzen, indem Sie die Rinde mit der Spitze der Spritzen abreißen, um die Follikel aus dem Stroma zu lösen.
Anmerkungen: Berühren Sie die Follikel nicht mit den Spritzen, um sie nicht zu beschädigen. - Übertragen Sie die Follikel mit der Mikrokapillare in eine 4-Well-Platte, die Tropfen von 15 μl des kalibrierten Nährmediums enthält, bedeckt mit 500 μl Ölkultur (1 bis 10 Follikel pro Tropfen). Dieser Schritt erhält die Lebensfähigkeit der Follikel während des Entnahmeprozesses. Spülen Sie die Follikel am Ende des Eingriffs zweimal für jeweils 5 s in zwei Tropfen von 15 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bedeckt mit 500 μl Ölkultur (auf Eis).
- Sammeln Sie 20 Follikel mit einer minimalen Menge PBS mit der Mundpipette (maximal 10 μl) in einem leeren Röhrchen und bewahren Sie das Röhrchen auf Eis auf.
HINWEIS: Für die RNA-Stabilität ist es entscheidend, die Schritte 2.8 und 2.9 auf Eis durchzuführen. Etwa 20 Follikel (<75 μm) werden benötigt, um genügend RNA für die Standard-RT-qPCR (SYBR Green) zu haben. - Nach maximal 90 Minuten Inkubation im Verdauungsmedium wird die enzymatische Reaktion gestoppt, indem ein Überschuss an kalter (4 °C) Blockierlösung (7,5 ml) in die Petrischale gegeben wird, die aus einem Nährmedium besteht, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) angereichert ist.
Anmerkungen: Die Blockierlösung kann hinzugefügt werden, sobald der Experimentator beobachtet, dass Follikel auf der Platte haften oder Follikel beschädigt werden (asymmetrische Form oder dunklere Follikel). Es wird empfohlen, die Follikelisolierung innerhalb eines Zeitraums von maximal 2,5 Stunden durchzuführen, um eine Follikelschädigung zu vermeiden, und die RNA-Extraktion sofort nach der Isolierung durchzuführen.
3. RNA-Extraktion
HINWEIS: Die RNA-Extraktion wird gemäß den Anweisungen durchgeführt, die mit einem RNA-Extraktionskit geliefert werden, indem die Elutionsvolumina angepasst werden.
- Suspendieren Sie die isolierten Follikel, indem Sie 100 μl der mit dem RNA-Extraktionskit gelieferten Lyselösung in das Röhrchen mit den Follikeln unter einer chemischen Haube geben und mit hoher Geschwindigkeit (2.500 U/min) vortexen, um die Struktur der Follikel aufzubrechen. Geben Sie 50 μl Ethanol (100 %) in das Röhrchen und wirbeln Sie kurz mit hoher Geschwindigkeit.
Anmerkungen: Da der Lysepuffer 2-Mercaptoethanol und Thiocyansäure enthält, muss dieser Schritt mit Vorsicht unter einer chemischen Haube durchgeführt werden. - Das Gesamtvolumen des Röhrchens (ca. 160 μl) wird in eine Mikrofilterpatronenanordnung übertragen, die aus einer Säule und einem Sammelröhrchen besteht, und es wird 10 s lang bei 16.363 x g bei 4 °C zentrifugiert. Waschen Sie die Säule mit 180 μl Waschlösung 1, die im Lieferumfang enthalten ist, und zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 s lang bei 16.363 x g bei 4 °C.
- Geben Sie 180 μl der mit dem Kit gelieferten Waschlösung 2/3 in die Säule und zentrifugieren Sie sie 10 s lang bei 16.363 x g bei 4 °C. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus. Zentrifugieren Sie das Röhrchen ein letztes Mal für 1 Minute, um den Filter zu trocknen, und legen Sie ein neues Auffangröhrchen unter die Kartusche.
- Führen Sie die Elution der Nukleinsäuren in zwei Schritten durch:
- Zuerst werden 8 μl warme Elutionslösung (75 °C) in den Filter gegeben, 1 Minute bei RT gewartet und 30 s bei 16.363 x g bei 4 °C zentrifugiert.
- Wiederholen Sie diesen Schritt mit 7 μL Elutionslösung.
Anmerkungen: Das Röhrchen mit den eluierten Nukleinsäuren muss auf Eis aufbewahrt werden. Um eine DNA-Kontamination zu vermeiden, wird ein zusätzlicher Schritt des DNA-Abbaus dringend empfohlen - Schritt 3.5.
- Inkubieren Sie das Röhrchen mit 2 IE DNase und 1x DNase-Puffer für 20 min bei 37 °C. Blockieren Sie die enzymatische Aktivität mit einem 1/10 DNase-Inaktivierungsreagenz für 2 min bei RT.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen 1,5 min lang bei 16.363 x g bei 4 °C. Sammeln Sie schließlich die Suspension mit der RNA und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen.
- Beurteilen Sie die Menge der in der Probe vorhandenen RNA mit einem Spektralphotometer (NanoDrop 2000 Software > Nukleinsäure > RNA). Verwenden Sie 1 μl Elutionslösung als Blind und messen Sie die RNA-Menge, die aus isolierten Follikeln extrahiert wurde, mit 1 μl Lösung.
- Überprüfen Sie das Verhältnis 260/280 auf RNA-Reinheit (ca. 2,0). Lagern Sie die Probe bei −80 °C oder transkribieren Sie sie direkt, um eine RT-qPCR durchzuführen.
HINWEIS: Um die RNA-Integrität zu beurteilen, kann die Probe vor oder nach dem Einfrieren bei −80 °C mit einem hochauflösenden automatisierten Elektrophoresesystem prozessiert werden. In dieser Arbeit wurde nach der Retrotranskription die RT-qPCR mit folgendem Zyklus durchgeführt:
Haltebühne mit 20 s bei 50 °C und 10 min bei 95 °C
40 PCR-Zyklen à 15 s bei 95 °C und 1 min bei 60 °C
Schmelzkurvenstufe mit 15 s bei 95 °C, 1 min bei 60 °C, 30 s bei 95 °C und 15 s bei 60 °C
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Representative Results
Mit diesem Isolationsverfahren kann der Experimentator Follikel aus der Stromaumgebung entnehmen, um spezifische Genexpressionsanalysen durchzuführen. Anhand der Größe und Morphologie der Follikel ist es möglich, die verschiedenen Stadien der Follikulogenese zu unterscheiden. Der Experimentator kann die interessierenden Follikel entsprechend ihrer Größe mit einer angepassten Mikrokapillarpipette auswählen. Durch die Verwendung einer Mikrokapillare von maximal 75 μm ist es möglich, primordiale und primäre Follikel von sekundären, antralen und reifen Follikeln zu unterscheiden. Darüber hinaus kann der Experimentator das Follikelstadium anhand der Follikelmorphologie bestätigen. Bei der Untersuchung der Follikelaktivierung werden ruhende und primäre Follikel ausgewählt, und es werden ungefähr 20 Follikel benötigt, um eine RNA-Konzentration von etwa 5 ng/μl zu erreichen.
Zwei homogenisierte Ovarialfragmente (4 mm x 2 mm x 1 mm) derselben Patientin wurden mit diesem Protokoll verarbeitet, um Follikel zu isolieren (Abbildung 2). Nach einer 1,5-stündigen Isolationsprozedur wurden zwei Populationen von Follikeln entsprechend den Entwicklungsstadien entnommen, um die RNA-Menge zu vergleichen und die Relevanz der Follikelauswahl hervorzuheben: 20 Follikel von <75 μm (Röhrchen 1) und 15 Follikel von <200 μm (Röhrchen 2). Anschließend wurde eine RNA-Extraktion durchgeführt, bei der 4,8 ng/μl Gesamt-RNA aus Röhrchen 1 und 10,5 ng/μl Gesamt-RNA aus Röhrchen 2 mit einem Spektralphotometer zur Quantifizierung gewonnen wurden (Tabelle 1). Mit diesem Mikrovolumen-Spektralphotometersystem wurde auch das Verhältnis 260/280 gemessen, um die RNA-Reinheit zu beurteilen. Dieses Verhältnis spiegelt die potenzielle Kontamination durch Proteine oder andere Reagenzien während der Extraktion wider und muss für RNA-Proben nahe bei 2,0 liegen. Die 260/280-Verhältnisse betrugen 1,89 bzw. 1,74 in Röhrchen 1 bzw. Röhrchen 2, was die Reinheit der Proben bestätigt (Tabelle 1). Die RNA-Qualität wurde dann durch die Prozessierung der Proben mit hochauflösender automatisierter Elektrophorese überprüft. Im Anschluss an dieses Verfahren wurde die RNA-Integritätszahl (RIN) abgeschätzt. Der RIN-Wert von 1 (degradiert) bis 10 (intakt) spiegelt den Grad des Abbaus der RNA in einer Probe wider. Die RIN-Werte betrugen 7,1 bzw. 7,9 in Röhrchen 1 bzw. Röhrchen 2, was die Qualität der RNA aus unseren Proben validiert (Tabelle 1). Um eine RT-qPCR durchzuführen, wurde zunächst das Gesamtvolumen der extrahierten RNA in cDNA retrotranskribiert. Anschließend wurden 1,25 ng cDNA pro Well auf einer 96-Well-Platte mit Primern für Housekeeping- und Zielgene (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase [HPRT], Kit-Ligand [KL] und Growth Differentiation Factor 9 [GDF9]) und SYBR Green-Mastermix17,18 hinzugefügt. Nach Durchführung eines Standardzyklus auf einem Real-Time-PCR-System betrugen die erhaltenen Zyklusschwellenwerte (Ct) 30,87 (Röhrchen 1) und 29,56 (Röhrchen 2) für HPRT, 33,5 (Röhrchen 1) und 31,77 (Röhrchen 2) für KL und 30,71 (Röhrchen 1) und 30,57 (Röhrchen 2) für GDF9 (Tabelle 1).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methode zur Beurteilung der RNA-Extraktion aus isolierten humanen Ovarialfollikeln. In diesem Manuskript werden drei Schritte beschrieben: das Auftauen des Gewebes, das Isolationsverfahren einschließlich der mechanischen und enzymatischen Verarbeitung und die RNA-Extraktion aus den Follikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Entnommene Follikel nach dem Isolationsprotokoll. (A) Aufgetautes kortikales Gewebe. (B) Der Gewebeschneider und (C) Gewebezerkleinerer, die zum Zerkleinern des Gewebes verwendet werden. (D-E) Bilder von entnommenen isolierten Follikel, die mit einem Stereomikroskop mit einem 10-fachen Okular und einem weiten Zoombereich (1x-6,3-fach) beobachtet wurden; Für die Identifizierung von Primordial- und Primärfollikeln wurden Vergrößerungseinstellungen von 50x-63x verwendet. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Rohr | Anzahl der Follikel | Größe der Follikel (μm) | RNA-Konzentration (ng/μL) | Verhältnis 260/280 | RNA-Integritätszahl (RIN) | HPRT Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tabelle 1: Reinheits-, RIN- und Zyklusschwellenwerte von zwei homogenisierten Ovarialfragmenten.
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Discussion
Die Kryokonservierung von Eierstockgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Fruchtbarkeit von Krebspatientinnen zu erhalten. In der Klinik wird aufgetautes kortikales Gewebe nach der Remission wieder in die Patientin transplantiert, was die Wiederaufnahme der Eierstockfunktion und der Fruchtbarkeit ermöglicht19,20. Neben der klinischen Verwendung können am Ende der Lagerzeit auch verbleibende Eierstockfragmente für die Forschung gespendet werden, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Follikulogenese regulieren. Darüber hinaus ist dieses Gewebe besonders nützlich für die Entwicklung von Alternativen zur Transplantation, wenn dies nicht möglich ist, wie z. B. In-vitro-Kultursysteme oder künstliche Eierstöcke. Unterschiede sowohl innerhalb als auch zwischen Patienten schränken jedoch die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Experimente und die Interpretation der Ergebnisse ein. Tatsächlich nimmt die Follikeldichte mit zunehmendem Alter dramatisch ab, und die Follikel sind nicht gleichmäßig auf die Fragmente verteilt21. Da die Anzahl der verfügbaren Fragmente begrenzt ist, muss menschliches Gewebe mit modernsten Techniken verwendet werden. Eine breite Palette von Techniken wie Immunhistochemie und Immunfluoreszenz sowie In-situ-Hybridisierung können an fixiertem Gewebe durchgeführt werden, um die Protein- und Genlokalisation zu beurteilen 3,18. Um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Follikulogenese innerhalb der funktionellen Einheiten des Eierstocks in verschiedenen Entwicklungsstadien regulieren, ist die Isolierung von Follikeln erforderlich.
In mehreren Studien wurden wirksame Methoden zur Trennung von Follikeln vom umgebenden Gewebe bei menschlichen und tierischen Spezies untersucht22. Die Anzahl der entnommenen Follikel und die Qualität der RNA nach der Extraktion können je nach verwendeter Technik variieren. Um die Aktivierung der Follikel (d. h. primordiale und primäre Follikel) zu untersuchen, werden mindestens 20 gepoolte Follikel benötigt, um eine Standard-RT-qPCR durchzuführen. Durch den Einsatz alternativer Methoden wie RNA- oder cDNA-Amplifikation oder nested PCR ist es möglich, mit weniger Follikeln zu arbeiten23,24.
Die dichte Beschaffenheit der Ovarialrinde macht die Follikelisolierung zu einer Herausforderung, was zum Einsatz von Methoden geführt hat, die eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Isolierung beinhalten25. Es können verschiedene Arten von Enzymen verwendet werden, wie z. B. Kollagenase undDNase 26. Studien haben jedoch über Follikelschäden nach enzymatischer Verdauung berichtet, die sich auf die weitere In-vitro-Entwicklung auswirken27,28. Um die Follikelintegrität aufrechtzuerhalten, verwenden mehrere Teams derzeit angepasste enzymatische Verdauungsprotokolle oder führen nur eine mechanische Isolierung für die anschließende Follikelkultur durch 25,29,30,31. Dieses Manuskript berichtet über eine einfache und effiziente Methode zur Gewinnung isolierter Follikel für die quantitative PCR-Analyse. Nichtsdestotrotz erfordern alle Experimente eine Lernkurve, bevor optimale Ergebnisse erzielt werden.
Zu Zwecken der Grundlagenforschung wurde eine Revision eines früheren Protokolls entwickelt, um eine große Menge von Follikeln zu gewinnen, ohne deren Integrität zu beeinträchtigen13. Die Verarbeitung für die Genexpressionsanalyse erfolgt direkt nach der Isolierung, um die RNA-Qualität zu optimieren. Es ist auch wichtig, eine längere Verdauung zu vermeiden, um das Risiko der Selektion degenerierter Follikel zu begrenzen. Daher bleibt der Schritt des Aufschlusses in diesem Protokoll von entscheidender Bedeutung. Drei Punkte erfordern besondere Aufmerksamkeit: (1) das Spülen des Gewebes während der enzymatischen Reaktion alle 10 Minuten, um eine homogene Enzymwirkung zu gewährleisten; (2) die Kontrolle der Follikelintegrität durch die Auswahl gesunder Follikel während des Eingriffs und das Stoppen der Reaktion mit der Blockierungslösung, sobald eine Schädigung festgestellt wird; (3) die Anpassung der Kollagenase-Konzentration, da die Gewebesteifigkeit je nach Alter von Patient zu Patient variieren kann. Die Kollagenasekonzentration kann in einigen Fällen auf 0,12 % gesenkt werden, um Schäden zu verhindern (z. B. bei präpubertären Patienten)32.
Im letzten Teil dieses Protokolls wurde die RNA-Extraktion aus isolierten Follikeln nach angepassten Anweisungen durchgeführt. Dies ermöglicht eine Vielzahl von Experimenten, wie z. B. RT-qPCR oder RNA-Sequenzierung, die grundlegende Informationen über verschiedene zelluläre Prozesse liefern, die spezifisch für Eizellen und Granulosazellen sind. Es stehen zahlreiche Protokolle und Kits zur Verfügung, um RNA aus Gewebe zu extrahieren. Wir haben hier über eine effiziente Technik berichtet, die in unserem Labor verwendet wird und die Extraktion einer ausreichenden Menge an RNA ermöglicht, um Genexpressionsanalysen mittels RT-qPCR durchzuführen. Während die direkte RNA-Extraktion nach der Follikelisolierung dringend empfohlen wird, um die RNA-Integrität zu erhalten, ist es auch möglich, die isolierten Follikel bei −80 °C einzufrieren, wenn die Extraktion nicht am selben Tag durchgeführt werden kann. Die RNA-Menge kann je nach Größe der Follikel variieren, und wachsende Follikel können die Analyse beeinträchtigen, wenn sie mit den ruhenden Follikeln gepoolt werden. Die Selektion auf der Grundlage der Größe ist abhängig von den Zielen der Studie äußerst relevant, insbesondere für den ersten Schritt der Follikulogenese. Die Unterscheidung zwischen primordialen und primären Follikel, die nur auf der Größe basiert, bleibt jedoch eine Herausforderung, wenn es darum geht, die Genexpression der primordialen Follikel richtig zu beurteilen. Die Selektion von Primordial- und Primärfollikeln kann anhand ihrer Morphologie erfolgen, aber die Unterscheidung zwischen ihnen mit einem Stereomikroskop bei einer 63-fachen Vergrößerung ist schwierig.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich der Experimentator der Herausforderungen der Follikelisolierung bewusst sein und diese bei der Analyse der Ergebnisse berücksichtigen muss. Wichtige Parameter müssen berücksichtigt werden, wie z. B. (1) Intra-/Intervariationen der Follikeldichte zwischen den Patienten; (2) Follikelintegrität während der Follikelisolierung; (3) Unterscheidung zwischen verschiedenen Follikelstadien; und (4) RNA-Stabilität und -Integrität.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Excellence of Science (EOS) Grant (ID: 30443682) unterstützt. I.D. ist assoziierter Forscher am Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
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