Summary
El presente protocolo describe la reprogramación del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y las células epiteliales ductales pancreáticas normales en células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Proporcionamos un procedimiento optimizado y detallado, paso a paso, desde la preparación de lentivirus hasta el establecimiento de líneas estables de iPSC.
Abstract
La generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando factores de transcripción se ha logrado a partir de casi cualquier tipo de célula diferenciada y ha demostrado ser muy valiosa para la investigación y las aplicaciones clínicas. Curiosamente, se ha demostrado que la reprogramación iPSC de las células cancerosas, como el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), revierte el fenotipo invasivo de PDAC y anula el epigenoma del cáncer. La diferenciación de las iPSC derivadas de PDAC puede recapitular la progresión de PDAC a partir de su precursor temprano de la neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando los cambios moleculares y celulares que ocurren temprano durante la progresión de PDAC. Por lo tanto, las iPSC derivadas de PDAC se pueden utilizar para modelar las primeras etapas de PDAC para el descubrimiento de marcadores de diagnóstico de detección temprana. Esto es particularmente importante para los pacientes con PDAC, que generalmente se diagnostican en las etapas metastásicas tardías debido a la falta de biomarcadores confiables para las etapas anteriores de PanIN. Sin embargo, la reprogramación de líneas celulares cancerosas, incluida la PDAC, en pluripotencia sigue siendo un desafío, requiere mucha mano de obra y es muy variable entre las diferentes líneas. Aquí, describimos un protocolo más consistente para generar iPSCs a partir de varias líneas celulares PDAC humanas utilizando vectores lentivirales bicistrónicos. Las líneas de iPSC resultantes son estables, no mostrando dependencia de la expresión exógena de factores de reprogramación o fármacos inducibles. En general, este protocolo facilita la generación de una amplia gama de iPSCs derivadas de PDAC, lo cual es esencial para descubrir biomarcadores tempranos que sean más específicos y representativos de los casos de PDAC.
Introduction
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC, por sus siglas en inglés) es una de las neoplasias malignas más mortales, y el diagnóstico precoz sigue siendo un reto debido a la naturaleza asintomática de la enfermedad. La mayoría de los pacientes con PDAC son diagnosticados en el estadio metastásico avanzado, cuando se dispone de opciones de tratamiento muy limitadas 1,2. Esto se debe principalmente a la falta de biomarcadores fiables para las primeras etapas, como los que podrían detectarse convenientemente como proteínas liberadas en el torrente sanguíneo.
El PDAC puede diseminarse muy temprano durante su progresión, y un mejor pronóstico se ha relacionado con la detección temprana del cáncer cuando el PDAC se localiza en el páncreas3. Sin embargo, menos de una décima parte de los pacientes con PDAC son diagnosticados con un pronóstico favorable, lo que permite la resección quirúrgica. No obstante, los pocos con tumores resecables también son propensos a la recurrencia tumoral dentro de los 12 meses4.
En las últimas cinco décadas, se han logrado mejoras notables en las técnicas quirúrgicas, la atención al paciente y las modalidades de tratamiento 5,6. Sin embargo, la tasa de supervivencia a 5 años en pacientes con PDAC resecados quirúrgicamente apenas ha aumentado al 17%. Sin embargo, sigue siendo mejor que la de los pacientes no resecados, que se ha mantenido casi sin cambios (0,9%)4,7. La quimioterapia es el único otro tratamiento alternativo para el PDAC. Sin embargo, esta opción es muy limitada, ya que la gran mayoría de los pacientes con PDAC presentan una fuerte resistencia a los medicamentos quimioterápicos como la gemcitabina 7,8. Otros fármacos, como el erlotinib, solo están disponibles para un pequeño grupo de pacientes con PDAC con mutaciones específicas, la mayoría de los cuales muestran resistencia al erlotinib9. Los efectos secundarios adversos asociados a la quimioterapia en la mayoría de los pacientes con PDAC son otra desventaja de este tratamiento10. Recientemente, estrategias prometedoras han demostrado que los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI) y los inhibidores de la quinasa de molécula pequeña (SMKI) pueden ser eficaces en el tratamiento de la PDAC, pero las respuestas duraderas a estas terapias dirigidas siguen estando limitadas a una minoría de pacientes11,12. En general, el descubrimiento de biomarcadores tempranos específicos de PDAC puede allanar nuevas vías para el diagnóstico y el tratamiento tempranos.
El PDAC se desarrolla a partir de lesiones precursoras de neoplasias intraepiteliales pancreáticas (PanIN) que resultan de proliferaciones epiteliales no invasivas del conducto pancreático13,14. Si bien la formación de PanIN se inicia por mutaciones oncogénicas como KRAS, se requieren alteraciones genéticas y epigenéticas adicionales para la progresión a PDAC. Se ha proyectado que la progresión de la PanIN a través de las diferentes etapas hasta el PDAC invasivo tarda unos 10 años 13,15,16,17. Este período de tiempo ofrece una gran oportunidad para beneficiarse del diagnóstico precoz de PDAC. Por lo tanto, se ha llevado a cabo una amplia investigación para establecer modelos animales de xenoinjertos tumorales y cultivos de organoides para estudiar la progresión de PDAC 18,19,20,21. Estos modelos han sido muy útiles para estudiar las etapas invasivas de PDAC, aunque no la transición de las fases tempranas de PanIN. Por lo tanto, es importante desarrollar modelos experimentales que puedan recapitular la progresión temprana de las etapas de PanIN para permitir el descubrimiento de biomarcadores de detección temprana.
La reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando los cuatro factores de transcripción OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC (OSKM) ha ilustrado el alcance de la plasticidad celular22. La plasticidad de las células cancerosas ha sido bien documentada, y la reprogramación de células cancerosas humanas en iPSC se ha utilizado con éxito para restablecer las células a su estado celular original, eliminando muchas de las agresiones epigenéticas que se han acumulado durante la progresión del cáncer 23,24,25,26,27,28,29. Por lo tanto, la posibilidad de utilizar esta estrategia de reprogramación para manipular la identidad de las células cancerosas ha sido muy prometedora en el tratamiento del cáncer30,31. De hecho, hemos demostrado previamente que la diferenciación de las iPSCs derivadas de las PDACs puede recapitular la progresión de las PDAC a través de las primeras etapas de PanIN32. Mediante la identificación de genes y vías específicas de las etapas tempranas e intermedias del PDAC, se identificaron biomarcadores candidatos que pueden ser utilizados clínicamente para el diagnóstico precoz del PDAC32,33. Sin embargo, los biomarcadores descubiertos utilizando una sola línea de iPSC mostraron una cobertura limitada en la mayoría de los pacientes con PDAC32. Los desafíos de generar líneas de iPSC a partir de otros pacientes con PDAC han detenido la capacidad de descubrir biomarcadores más confiables. Esto se debe a muchos factores técnicos, incluida la heterogeneidad de la administración de OSKM, ya que solo una pequeña parte de las células PDAC primarias humanas contenían los cuatro factores y respondieron con éxito a la reprogramación. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la reprogramación de células PDAC primarias utilizando una administración lentiviral dual más eficiente y consistente de OSKM.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de OHSU. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes. Todos los trabajos con animales para los tumores PDX se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de OHSU. Este protocolo se probó en células PDAC primarias de xenoinjerto derivado del paciente (PDX), línea celular BxPc3 que exhibe morfología epitelial que se aisló del tejido pancreático de una paciente femenina de 61 años con adenocarcinoma, la línea celular epitelial inmortalizada H6C7 derivada del epitelial del conducto pancreático humano normal y fibroblastos humanos primarios derivados de la biopsia de piel de individuos sanos. Las muestras humanas de PDAC se obtuvieron bajo el estudio del Registro de Tejidos de Páncreas de Oregón (IRB00003609). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos. Los fibroblastos primarios humanos se derivaron en RBiomedical, Edimburgo, Reino Unido, a partir de muestras de piel de donantes anónimos sometidos a cirugía de rutina en el Edinburgh Royal Infirmary, Little France, Reino Unido, bajo su consentimiento y aprobación ética (09/MRE00/91). Todo el trabajo de lentivirus se ha llevado a cabo en el marco de una actividad de investigación de Clase 2 (GM207/16.6) y ha sido aprobado por el Departamento de Salud y Seguridad de la Universidad de Edimburgo y notificado a la autoridad competente en materia de salud y seguridad del Gobierno escocés. Todos los experimentos de reprogramación con células pancreáticas humanas se llevaron a cabo bajo la aprobación ética del comité de ética de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Edimburgo (referencia # asoufi-0002).
1. Preparación de lentivirus
- Para la preparación de lentivirus, preparar plásmidos de envasado y expresión de alta calidad (libres de endotoxinas) con concentraciones entre 1 y 2 μg/μL, incluidos psPAX2, pMDG34 y dos vectores bicistrónicos que contengan RES; la codificación de pSIN4-EF1a-O2S para la expresión de OCT4 y SOX2 impulsada por el promotor EF-1α, y pSIN4-CMV-K2M para la expresión de KLF4 y c-MYC bajo el potenciador/promotorCMV 35 (ver Tabla de Materiales). Además, prepare el plásmido pWPT-GFP para utilizarlo como control de transfección.
- Descongele la línea celular de riñón embrionario humano (293T) y cultivo en el Medio Mínimo Esencial (GMEM) de Glasgow, suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (FCS), 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio y 1 mM de glutamina a (ver Tabla de Materiales) 37 °C y 5% de CO2.
NOTA: Se recomienda utilizar células 293T dentro de los cuatro pasos posteriores a la descongelación. - Sembrar 293T a una densidad de 3 millones de células por plato de 15 cm, 24 h antes de la transfección. Se requieren un total de tres platos. Es preferible sembrar las células más tarde en la tarde ~ 16:00.
- Al día siguiente (~16:00), cuando las células alcancen ~40%-50% de confluencia, prepare lo siguiente para tres reacciones de transfección:
NOTA: Siempre tenga en cuenta el error de pipeteo agregando un 10% de volumen adicional.- Etiquete tres tubos de plástico de 15 ml con el nombre de lentivirus apropiado (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M y control de pwPT-GFP). Añadir 1.710 mL de medio sérico reducido (ver Tabla de Materiales) a cada tubo.
- Diluir 90 μL de reactivo de transfección (ver Tabla de Materiales) en 1,710 mL de medio sérico reducido, mezclar por vértice durante 2 s e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Mezcle los vectores de empaque; 5,1 μg de psPAX2 y 2,4 μg de pMDG (7,5 μg en total).
- Añadir la mezcla de vectores de envasado al medio de transfección (a partir del paso 1.4.2) y al vórtice durante 2 s.
- Añadir 7,5 μg de cada vector de reprogramación: pSIN4-EF1a-O2S y pSIN4-CMV-K2M y el control pwPT-GFP a la mezcla de transfección del paso (1.4.4) y del vórtice durante 2 s.
NOTA: Utilice la expresión vector: vector viral en una proporción de 1:1.
- Incubar los tubos de transfección durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Transfectar las células 293T con cada lentivirus añadiendo directamente la mezcla de transfección y ADN del paso (1.4.5) al medio gota a gota. Gire el plato para asegurar una distribución uniforme en toda la superficie.
- Incubar las células transfectadas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche.
NOTA: Use desechos específicos para virus, un balde de trituración de metal, una bolsa doble con bolsas de autoclave y tome un contenedor de desechos líquidos para virus y agregue una tableta desinfectante. Deseche todas las pipetas, puntas y tubos en un cubo de metal. Deseche los medios viejos en un contenedor de desechos líquidos de virus. Evite el uso de pipetas de vidrio y cristalería para eliminar la contaminación accidental por virus. - Después de 14-16 h después de la transfección, reemplace el medio con 30 ml de medio 293T fresco.
- Incubar las células transfectadas a 37 °C, 5% CO2 durante 60-72 h después del cambio de medio. Observe las células diariamente y verifique la eficiencia de la transfección mediante fluorescencia GFP.
NOTA: Idealmente, la eficiencia de la transfección debe ser del >90% por GFP. Para los otros virus, se deben observar cambios morfológicos claros de las células 293T, ya que tienden a volverse más redondas cuando producen partículas de virus. - Recoja los medios de cada cultivo de transfección de virus en tubos de 50 ml y gírelos hacia abajo para eliminar los restos celulares a 1932 x g durante 10 min a 4 °C.
- Filtre cada sobrenadante de lentivirus a través de un filtro de jeringa de 0,45 μM para eliminar los residuos más pequeños y recogerlos en nuevos tubos de 50 ml.
- Divida cada sobrenadante de lentivirus en alícuotas de 6 ml y congele cada una en nitrógeno líquido.
- Almacene las alícuotas de lentivirus a -80 °C hasta que estén listas para su uso.
2. Reprogramación de la transducción de lentivirus
- Descongele las células PDAC primarias y cultive en un medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) completamente definido, suplementado con extracto de hipófisis bovina (BPE), factor de crecimiento epidérmico (EGF) recombinante humano a 5 ng/ml y toxina del cólera a 50 ng/ml en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 y 5% de O2 (hipoxia) (ver Tabla de materiales).
- Descongele BxPc3, una línea celular de adenocarcinoma ductal pancreático escamoso, y cultivo en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal (FCS) al 10% a 37 °C y 5% de CO2.
- Descongele las células H6C7, las células epiteliales ductales pancreáticas y el cultivo en KSFM suplementado con BPE y EGF a 5 ng/mL, a 37 °C y 5% de CO2.
- Descongele fibroblastos humanos (fibFib) y cultivo en el Medio Mínimo Esencial (GMEM) de Glasgow, suplementado con FCS al 10%, 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio y 1 mM de glutamina, y 0,05 mM (final) de beta-mercaptoetanol a 37 °C y 5% deCO2.
- Un día antes de la transducción de lentivirus (preferiblemente al final de la tarde), prepare dos pocillos de una placa de 6 pocillos que contenga 100.000 células por pocillo de cada una de las células PDAC, BxPc3, H6C7 y hFib. Infecte un pocillo con lentivirus OSKM y use el segundo como control no infectado.
NOTA: Utilice una placa separada para cada tipo de celda. - Al día siguiente, por la tarde (aproximadamente 24 h más tarde), asegúrese de que la confluencia celular alcance al menos el 70% antes de pasar al siguiente paso de infección por lentivirus.
3. Transducción de lentivirus de PDAC
- Descongelar 5 ml de cada sobrenadante de lentivirus en una incubadora de virus a 37 °C.
- Prepare dos tubos de 15 ml, cada uno de los cuales contiene 2 ml de medio de cultivo PDAC precalentado.
- Al primer tubo, añadir 6 ml de cada lentivirus de reprogramación (pSIN4-CMV-K2M y pSIN4-EF1a-O2S) y 12 μl de polibreno de 4,5 mg/ml (4,5 μg/ml finales, ver tabla de materiales) y mezclar.
- Al segundo tubo, añadir 2 μL de 4,5 mg/mL de polibreno (4,5 μg/mL final).
- Deseche el medio de cada pocillo y lávese una vez con PBS a temperatura ambiente.
- Agregue el medio de infección de reprogramación (tubo 1) al primer pocillo.
- Agregue la mezcla del tubo 2 al segundo pocillo. Este será el control no infectado.
- Incubar las células PDAC en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 y 5% de O2 (hipoxia) durante la noche.
- Al día siguiente, por la tarde, deseche el medio de ambos pocillos y reemplácelo con medio de cultivo PDAC fresco.
- Incubar las células a 37 °C, 5% de CO2 y 5% deO2 (hipoxia) durante 48 h.
4. Transducción de lentivirus de células BxPc3
- Descongelar 3 mL de cada sobrenadante lentivirus en una incubadora de virus a 37 °C.
- Prepare dos tubos de 15 ml, cada uno con 2 ml de medio de cultivo BxPc3.
- Al primer tubo, añadir 3 ml de cada lentivirus de reprogramación (pSIN4-CMV-K2M y pSIN4-EF1a-O2S) y 6 μl de polibreno de 4,5 mg/ml (4,5 μg/ml final) y mezclar.
- Al segundo tubo, añadir 2 μL de 4,5 mg/mL de polibreno (4,5 μg/mL final).
- Deseche el medio de cada pocillo y lávese una vez con PBS.
- Agregue el medio de infección de reprogramación (tubo 1) al primer pocillo.
- Agregue la mezcla del tubo 2 al segundo pocillo. Este será el control no infectado.
- Incubar las células BxPc3 infectadas a 37 °C de virus y 5% de CO2 durante la noche.
- Al día siguiente, por la tarde, deseche el medio de ambos pocillos y reemplácelo con medio de cultivo BxPc3 fresco.
- Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h.
5. Transducción de lentivirus de la infección por células H6c7
- Descongelar 4 ml de cada sobrenadante de lentivirus en una incubadora de virus a 37 °C.
- Prepare dos tubos de 15 ml, cada uno con 2 ml de medio de cultivo H6c7.
- Al primer tubo, añadir 4 ml de cada lentivirus de reprogramación (pSIN4-CMV-K2M y pSIN4-EF1a-O2S) y 8 μl de polibreno de 4,5 mg/ml (4,5 μg/ml final) y mezclar.
- Al segundo tubo, añadir 2 μL de 4,5 mg/mL de polibreno (4,5 μg/mL final).
- Deseche el medio de ambos pocillos y lávese una vez con PBS.
- Agregue el medio de infección de reprogramación (tubo 1) al primer pocillo.
- Agregue la mezcla del tubo 2 al segundo pocillo. Este será el control no infectado.
- Incubar las células H6C7 infectadas a 37 °C de virus y 5% de CO2 durante la noche.
- Al día siguiente, por la tarde, deseche los medios de ambos pocillos y reemplácelos con un medio de cultivo H6c7 fresco.
- Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h.
6. Transducción de lentivirus de células fibriladas
- Descongelar 2 ml de cada sobrenadante lentivirus en una incubadora de virus a 37 °C.
- Prepare dos tubos de 15 ml, cada uno con un medio de cultivo de 2 ml de fibril.
- Al primer tubo, añadir 2 mL de cada virus de reprogramación (pSIN4-CMV-K2M y pSIN4-EF1a-O2S) y añadir 4 μL de 4,5 mg/mL de polibreno (final 4,5 μg/mL) y mezclar.
- Al segundo tubo, agregue 2 μL de 4,5 mg/mL de polibreno (final 4,5 μg/mL) y mezcle.
- Deseche el medio de cada pocillo y lávese una vez con PBS.
- Agregue el medio de infección de reprogramación (tubo 1) al primer pocillo.
- Agregue la mezcla del tubo 2 al segundo pocillo. Este será el control no infectado.
- Incubar las células infectadas de fibrilación fibrilación fibrilación a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche.
- Al día siguiente, por la tarde, deseche el medio de ambos pocillos y reemplácelo con un medio de cultivo de fibrilación de fibrilación (fibril) fresco.
- Incubar las células a 37 °C y 5% deCO2 durante 48 h más.
NOTA: Para una transducción eficiente de lentivirus, titule la cantidad de lentivirus con cuidado, ya que esto varía mucho entre los diferentes tipos de células. Es posible que se requieran múltiples transducciones de lentivirus para algunos tipos de células. Las líneas celulares PDAC requieren hasta tres dosis, mientras que una dosis fue suficiente para reprogramar las líneas BxPc3, H6C7 y hFib.
7. Preparación de las células alimentadoras iMEF
- Prepare 40 ml de solución de gelatina al 0,2 % diluyendo la solución madre de gelatina al 1 % con PBS.
- Cubra cuatro placas de 6 pocillos cubriendo cada pocillo con 2 ml de solución de gelatina al 0,2%.
- Incubar las placas recubiertas de gelatina a 37 °C y 5% de CO2 durante al menos 30 min.
- Aspire el exceso de solución de gelatina y deje que las placas se sequen debajo de la campana de flujo.
- Descongele dos viales (~ 4 millones de células por vial) de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados (iMEFs) agitándolos en un baño de agua a 37 °C.
NOTA: Para reducir la posibilidad de contaminación, tenga cuidado de evitar que el agua salpique cerca de la abertura de la tapa. Seque el vial con una toalla de papel y rocíelo con etanol al 70%. - En la campana de cultivo de tejidos, pipetee el contenido de cada vial de iMEFs descongelado en un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de medio de cultivo de fibrilación fibrilada precalentado gota a gota y mezcle bien invirtiendo suavemente el tubo.
- Gire la suspensión celular a 309 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante de cada tubo. Vuelva a suspender cada gránulo celular en un medio de 12 ml de fibrilación fibrilada.
- Placa de 2 mL de la suspensión celular por pocillo de las placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina. Distribuya uniformemente las células agitando suavemente las placas en todas las direcciones.
- Incubar las placas a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche.
NOTA: Prepare las placas iMEF nuevas 24 h antes de utilizarlas para el experimento de reprogramación.
8. Transferencia de las células infectadas a la capa alimentadora del iMEF
- Deseche los medios de las células PDAC, BxPc3, H6c7 y fibL infectadas y no infectadas. Lave cada pocillo dos veces con PBS a temperatura ambiente.
- Disocie las células de la placa agregando 0,5 ml de tripsina a cada pocillo. Incubar las células PDAC en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 y 5% deO2 (hipoxia) durante 15 min.
- Incubar células BxPc3 a 37 °C y 5% de CO2 durante 5 min.
- Incubar las células H6c7 y hFib a 37 °C y 5% de CO2 durante 4 min.
- Transfiera la suspensión celular disociada de cada pocillo a tubos de 15 ml etiquetados como infectados o no infectados.
- Cosechar las células por centrifugación de la siguiente manera: para PDAC, girar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min; para BxPc3, gire la suspensión celular a 120 x g durante 5 min; para H6C7, gire la suspensión celular a 112 x g durante 4 minutos; para la fibrilación auricular, gire la suspensión celular a 161 x g durante 3 min. Realizar todas las centrifugaciones a temperatura ambiente.
- Vuelva a suspender cada gránulo de tipo celular en 1 ml del medio de cultivo adecuado.
- Lave dos veces las placas iMEF preparadas en el paso 7 con cada medio de cultivo de tipo celular. es decir, lave una placa con medios PDAC, otra con medios BxPc3, otra con medio H6C7 y la otra con medio hFib.
- Coloque 50.000 células infectadas por pocillo en cinco pocillos de la placa iMEF de 6 pocillos. Coloque 50.000 células de control no infectadas en el pocillo restante de la placa iMEF de 6 pocillos.
NOTA: Optimice el número de células infectadas que se van a sembrar de 1.000 a 50.000 células por pocillo. - Incubar las células PDAC a 37 °C, 5% de CO2 y 5% deO2 (hipoxia) durante la noche.
- Incubar las células BxPc3, H6C7 y hFib a 37 °C y 5% de CO2 durante la noche.
- Al día siguiente, prepare el medio de reprogramación de la siguiente manera: agregue 100 ml de reemplazo de suero knockout (25% final), 5 mL de 200 mM de glutamina (1 mM final), 5 mL de 100 aminoácidos no esenciales (100 μM final), 1,5 mL de beta-mercaptoetanol (0,1 mM final) a 400 mL de medio Eagle modificado (DMEM).
- Almacene el medio de reprogramación en alícuotas de 100 ml a 4 °C durante un máximo de 4 semanas o a -20 °C durante más tiempo.
- Cuando esté listo para usar, agregue 100 μL de 10 mg/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) (10 ng/mL final) a una alícuota de 100 mL de medio de reprogramación.
- Calentar el medio de reprogramación en un baño de agua a 37 °C.
- Lave dos veces las células que crecen en los alimentadores iMEFs con medios de reprogramación precalentados.
Agregue 2 ml de medio de reprogramación a cada pocillo. - Transfiera las placas de reprogramación a una incubadora a 37 °C, 5% de CO2y 3% de O2 (hipoxia).
NOTA: El día en que se agregan los medios de reprogramación se considera el día 1 de la reprogramación. - Alimente las células diariamente con nuevos medios de reprogramación hasta que comiencen a aparecer colonias de iPSC.
NOTA: Identifique las colonias de iPSC por su morfología similar a la de ESC (colonias compactas con bordes bien definidos y compuestas por células con una alta relación núcleo/citoplasma). - Monitoree las colonias de iPSC diariamente y, después de que se haya formado un número adecuado, páselas como una piscina.
NOTA: Asegúrese de que las colonias de iPSC no se toquen entre sí, ya que esto daría lugar a una diferenciación y afectaría a su estabilidad a largo plazo. - Para establecer líneas clonales, pase el grupo de iPSC unas 5 veces, luego elija colonias robustas que mantengan su morfología similar a la de ESC.
- Para identificar colonias de iPSC completamente reprogramadas, lleve a cabo la tinción viva con TRA-160 (consulte la tabla de materiales) y recoja ARN de colonias de iPSC para la caracterización de la expresión génica.
9. Pase de colonias iPSC
- Prepare suficientes placas de alimentación iMEF 24 h antes de pasar las colonias de iPSC como se describe en el paso 7.
- Lave las placas de alimentación iMEF dos veces con medios de reprogramación precalentados.
- Agregue 2 mL de medio de reprogramación suplementado con inhibidor de ROCK (Y2) (10 μM) a cada pocillo de la placa iMEF.
- Incubar las placas iMEF en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 y 3% deO2 hasta que estén listas para usar.
- Prepare una solución salina tamponada con ácido etilendiaminotetraacético/fosfato (EDTA/PBS) diluyendo EDTA 0,5 M 1:1000 en PBS (0,5 mM final).
- Reemplace el medio de cultivo de reprogramación con 0.5 mL de EDTA/PBS en cada pocillo.
- Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 y 3% de O2 o a temperatura ambiente, según el tipo de célula. Las iPSC BxPc3 y PDAC requieren 15 minutos de incubación a 37 °C. Las iPSC H6C7 y hFib deben incubarse a temperatura ambiente durante 5 min.
- Revise las células iPSC bajo el microscopio hasta que comiencen a disociarse uniformemente de la capa alimentadora en toda la colonia.
- Recoja la suspensión de la célula iPSC disociada en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Resuspender el gránulo celular en 1 mL de medio de reprogramación suplementado con Y2 (10 μM).
- Coloque las células en la capa de alimentación de iMEF transfiriendo cada 1 ml de suspensión de células iPSC a tres pocillos de la placa iMEF.
NOTA: La proporción de división puede variar según el número de colonias iPSC cosechadas. - Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 y 3% deO2 .
10. Tinción en vivo de colonias de iPSC con TRA-1-60
- Preparar 0,5 mL por pocillo de 4 μg/mL de anticuerpo TRA-1-60 en medios de reprogramación.
- Deseche los medios de reprogramación y reemplácelos con una mezcla de anticuerpos de 0,5 ml en cada pocillo. Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 y 3% deO2 durante 30 min.
- Lave las celdas dos veces con el medio de reprogramación.
- Capture imágenes de fluorescencia con un sistema de imágenes celulares utilizando el filtro GFP.
- Compruebe la calidad de la imagen teniendo en cuenta el canal de control negativo.
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Representative Results
En la Figura 1 se muestran imágenes representativas que muestran la morfología de las colonias de iPSC derivadas de las células PDAC, BXPc3, H6C7 y hFib. Las colonias PDAC-iPSC comenzaron a formarse el día 25 de la reprogramación. En el día 40 de la reprogramación se identificaron colonias robustas de iPSC con una morfología similar a la de ESC más establecida (Figura 1). Del mismo modo, la formación de BxPc3-iPSCs comenzó el día 23 y se estableció más en el día 35. La formación de H6C7-iPSC fue similar a la de PDAC-iPSC y comenzó a establecerse en el día 45. Las colonias de hFib-iPSC comenzaron a formarse el día 15 de la reprogramación.
Figura 1: Imágenes representativas de colonias de iPSC. Las imágenes muestran una morfología establecida similar a la de hESC derivada de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 y (D) hFib. Los días de reprogramación se indican encima de cada imagen. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se establecieron líneas clonales de iPSC a partir de cada reprogramación de las células PDAC, BxPc3, H6C7 y hFib. Todas las líneas de iPSC establecidas dieron positivo para TRA-1-60, un marcador indiferenciado de la superficie celular de las células ESC, lo que confirma su reprogramación a pluripotencia (Figura 2).
Figura 2: Imágenes representativas de líneas clonales de iPSC. Las imágenes se derivan de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 y (D) hFib que muestran una morfología similar a la de ESC (paneles superiores) y tinción positiva para TRA-1-60 (panel inferior). Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Con el fin de facilitar el uso de la reprogramación de iPSC para estudiar la progresión del cáncer, se ha establecido un protocolo sólido para la reprogramación de células de cáncer de páncreas. La reprogramación de las células cancerosas en pluripotencia ha demostrado ser muy difícil hasta ahora, ya que solo unos pocos estudios han generado con éxito iPSC a partir de células cancerosas 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 . La mayoría de estos estudios utilizaron líneas celulares cancerosas inmortalizadas para generar líneas iPSC, no células primarias derivadas del paciente 36,37,38,40,42,43,44,46. Por ejemplo, se intentó reprogramar cuatro líneas celulares diferentes de cáncer de hígado utilizando la introducción retroviral de factores OSKM, pero solo una sola línea celular se reprogramó con éxito41. Sin embargo, la línea iPSC de cáncer de hígado generada mostró una pérdida de stemness después de algunos pasos, destacando la alta resistencia de las células cancerosas a la reprogramación de OSKM41. Anteriormente, se intentó reprogramar las células PDAC utilizando la administración lentiviral de OSKM individualmente; sin embargo, solo se generó una única línea de iPSC, dependiente de la expresión exógena de OSKM y, por lo tanto, no completamente reprogramada37. Otro estudio utilizó vectores episomales para administrar factores OSKM sin integración genómica, pero solo logró generar un único clon de iPSC a partir de PDAC39. El éxito limitado en la reprogramación de células cancerosas se suma a los muchos desafíos que obstaculizan el uso de la tecnología iPSC en la investigación del cáncer.
Aquí, se explica la generación de iPSCs a partir de muestras primarias de PDAC derivadas de dos pacientes diferentes y una línea celular de PDAC establecida (BxPc3). Además, también se han generado iPSCs a partir de H6c7, una línea celular epitelial ductal pancreática. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de líneas iPSC estables derivadas con éxito de BxPc3 y H6c7. Siguiendo este protocolo, las iPSC también se han generado con éxito a partir de fibroblastos humanos primarios derivados de individuos sanos, ampliando la aplicabilidad del método más allá de la investigación del cáncer.
Uno de los elementos clave detrás del éxito del protocolo es el uso de vectores lentivirales bicistrónicos para coexpresar los factores de SG y KM. Estos vectores contienen el sitio de entrada interno del ribosoma 2 (IRES2) para expresar OCT4 y SOX2 en un vector y KLF4 y cMYC en el otro. Múltiples estudios que utilizan vectores monocistrónicos en los que cada factor de reprogramación se administró individualmente han demostrado que la captación de cada vector es diferente, lo que afecta a la estequiometría OSKM y a la eficiencia de la reprogramación47. El uso de vectores bicistrónicos puede ayudar a mitigar este problema. Además, el uso de IRES en vectores lentivirales ha mostrado un aumento significativo en la eficiencia de reprogramación48. En este sistema lentivirus, la expresión de SG es impulsada por el promotor EF1a, mientras que la expresión de KM está bajo el control de un promotor de CMV. Se sabe que el promotor del CMV puede ser sometido a un silenciamiento altamente eficiente por metilación del ADN y desacetilación de histonas, a diferencia de EF1a49,50. Por lo tanto, el silenciamiento temprano de la KM antes de la OS durante la reprogramación puede ser un factor clave para el éxito del protocolo. Esto es consistente con estudios previos que muestran la importancia de la dinámica de expresión de OSKM durante la reprogramación 51,52,53,54,55. Por lo tanto, el vector bicistrónico también es más ventajoso que el vector policistrónico, donde todos los factores OSKM se expresan a partir de un solo promotor56. Otros factores que contribuyen al éxito del protocolo son las dosis de infección por lentivirus y el número de células infectadas utilizadas para la reprogramación, que se personalizaron para cada tipo de célula.
En resumen, se presenta un método optimizado para reprogramar células PDAC primarias junto con otras líneas celulares y células normales. Este método ayudará a ampliar el uso de la reprogramación de iPSC para modelar la progresión del cáncer y, en este caso, descubrir biomarcadores tempranos de PDAC.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
A.S y J.K desean agradecer a Cancer Research UK y OHSU por su financiación (Premio al proyecto CRUK-OHSU C65925/A26986). A.S cuenta con el apoyo de un premio de desarrollo profesional del MRC (MR/N024028/1). A.A está financiado por una beca de doctorado (Beca ref. 1078107040) de la Ciudad Rey Abdulaziz para la Ciencia y la Tecnología. J.K está financiado por la Subvención para Nuevos Investigadores de MRF (GCNCR1042A) y la Subvención Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos al Prof. Keisuke Kaji por proporcionar amablemente el vector de reprogramación pSIN4-EF1a-O2S y pSIN4-CMV-K2M. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de esta presentación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
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