Summary
Введем новый способ поддержания человеческого слизистой оболочки кишечника в культуре и мониторинг ответ на различные типы стимулов по меньшей мере, 24 часов. С помощью нашего метода, полярность ткани сохраняется, что позволяет физиологический стимуляции через апикальную маршрута.
Protocol
1. Получение и подготовка ткани
- Тканей (здоровые или IBD слизистой оболочки) получают во время операции. Как только образец вырезан передачи в лабораторию как можно скорее, удерживая его в Ca + + / Mg + + HBSS без буфера с добавлением пенициллина / стрептомицина при 4 ° С или на льду.
* Размер образца зависит от наличия ткани: часть ткани, полученной, строго то, что не является необходимым для диагностики и могут значительно отличаться между здоровыми субъектами и IBD. Здоровые ткани вырезают из пациентов, перенесших операцию на рак толстой кишки.
- Вымойте ткань мягко и очистить его от всех брыжеечных материала. Отдельный слой слизистой оболочки с подслизистой использованием стерильных ножниц и щипцов, сохраняя при этом ткани в буфере HBSS в чашке Петри (не обязательно погружен). Нажмите на поверхности слизистой оболочки с пинцетом как можно меньше.
- Вырезать в слизистой оболочке полос по крайней мере, 1 Cм в ширину и как можно дольше. Используйте две стерильные скальпели, так же как если бы вы резки пищи.
- Отмыть слизистой оболочки нежно HBSS и продлить его на чашку Петри с апикальной стороны вверх.
2. Монтаж ткани
- Подготовить свежую среду (tisDMEM). Использование DMEM дополнена глютамин (2 мМ) и NaPyr (1 мМ) и добавляют 15% FBS-Na (фетальной бычьей сывороткой - североамериканский), 1% ЕЕ-X и 200 нг / мл EGF во время использования.
- Наполните 10 см чашки Петри с остальной частью FBS-Na (использовать около 30 мл, так что металлическая сетка будет полностью погружен) и погрузить металлических сеток. Храните пластины открыть и поддерживать в пластиковые цилиндры на кране.
* Металлическая сетка сделаны из железа. Сетки квадратной формы со стороной 0,5 мм.
- Возьмите 3 мкл хирургического клея с 10 или 20 мкл пипетки. Примените это тщательно, чтобы одна из границ пластикового цилиндра, удерживая ее жIRM с щипцами.
- Аккуратно цилиндра на апикальной стороне слизистой оболочки, как можно ближе к одной из границ полосы, насколько возможно.
- Чтобы дать клею время, чтобы прочно прикрепить цилиндр на ткань, подготовить центральный хорошо органной культуры пластина: Внесите 850 мкл-1 мл среды в центре хорошо и поддерживать металлической сеткой по краям центральной яме пластины.
- Срежьте избыточной ткани от границ цилиндра с помощью двух стерильных скальпелей, как раньше.
- Аккуратно поднимите цилиндр с прилагаемой ткани и поместите базолатеральным сторона на металлической сетке в центре пластины.
3. Стимуляция
- Используйте стимулы на ваш выбор в нужный концентрации.
- Применяют соответствующий объем в центре пластикового цилиндра, не нарушая цилиндра или поверхность слизистой оболочки с кончиком пипетки. Убедитесь, что выбранный вами объем равномерно покрывает поверхность внутри цилиндра. Вdicated объемах:
Большой пластиковый цилиндр: 200 мкл
Средний пластиковый цилиндр: 100 мкл
Малый пластиковый цилиндр: 50 мкл - Выдержите в течение до 3 часов в обычном инкубаторе.
* Если вы хотите инкубировать в течение более длительных, убедитесь, что вы используете гораздо меньший объем стимулов (10-20 мкл) и сразу сделать заказ ткани в атмосфере 100% О 2 в давлении 1 атм (см. 3.5) .
- Возьмите среде с стимулов от апикальной поверхности ткани и не заменяют свежей средой, потому что ткань не получает достаточное количество O 2, если толстый слой среды на апикальной лица предотвращает газообмен. Закройте планшет.
- Поместите ткань в атмосфере 100% О 2 в давлении 1 атм.
4. Уборка
- После 24 часов общего времени культуры (± 2,5 часа), осторожно снимите цилиндр из йэлектронной ткани с помощью скальпеля аккуратно очищая от клея и хранить его в зависимости от желаемого анализа (для иммуногистохимии исправить и / или иммунофлуоресцентные анализы, или оснастки замораживание в жидком N2 для очистки РНК и генов профилирования экспрессии или очистки белков и Западной анализов пятно ).
- Урожай базолатеральную среду для профилирования секреции цитокинов. Центрифуга при 8000 оборотов в минуту в течение 7 минут, чтобы мусор гранул, передавать супернатанта в пробирку Эппендорфа (в качестве альтернативы аликвоты) и немедленно хранят при -20 ° C.
* Если вы хотите сохранить супернатантами дольше, храните их при температуре -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Нам удалось в поддержании здоровья человека и IBD слизистую оболочку кишечника в культуре в течение по крайней мере 24 часов сохранения благополучия ткани. В соответствии с предыдущими наблюдениями 1, это было возможно только, если большинство времени культивирования (по крайней мере 85% от общего числа) состоялось в O 2, так как ткань не выжить в течение 24 часов в обычных инкубаторов (рис. 2). Мы также показали, что различные реакции эксплантатов можно наблюдать на этой модели в зависимости от полярности стимуляции (апикальный против базолатеральной) и иммуногенность стимулы 2,3.
Используя этот протокол, мы показываем, что различные пробиотические штаммы могут вызывать различные реакции со стороны тканей автора. Lactobacillus Plantarum NCIMB8826 оказалась на удивление иммуногенны на здоровые ткани. В отличие от двух других штаммов лактобацилл, она не только вызывает миграцию лимфоидных клеток палатах самой верхней поверхности слизистой оболочки, но также значительно повышающей регуляции хемокинов, имеющие отношение к этой миграции CCL4, а также IL-1b, цитокин, традиционно связанных с провоспалительные активности. К нашему удивлению, хотя мы ранее наблюдали профилактического действия Л. paracasei в мышиной модели колита 4, это не привело к лечебным эффектом, когда живые бактерии этого штамма наносили на воспаленные ткани IBD. Скорее, всех трех штаммов оказалось вредным при использовании на IBD слизистой оболочки в острой фазе заболевания 2.
Кроме того, мы показали, что метаболический продукт пробиотик, называемый postbiotic, способный экранирование здорового эпителия против довольно инвазивные Salmonella деформации (FB62), тогда как в то же время существенно улучшает воспламенение при нанесении на слизистую оболочку IBD 2.
_upload/4368/4368fig1.jpg "FO: Content-ширина =" 5 дюймов "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
Рисунок 1. Схематическое представление установки и фото.. Схематическое представление множества вверх вид сбоку, б. Схематическое представление множества вверх смотреть сверху, с. Фото металлической сетки, используемой в качестве поддержки эксплантата. При правильном расположении, только базолатеральную сторона получает в контакте с центральной камеры среднего, D. Фото всего ансамбля. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Ткани выживает только культуры в O 2.. Некультурных ткани, закрепленные по прибытию из операционной,
Рисунок 3 Влияние провоспалительных стимулов на C-эксплантов: Нестимулированные ткани культивировали в течение указанных временных точках; SAL:.. Тканей зараженных сальмонеллой и культивировали в течение указанные моменты времени. Разрушение верхнего слоя эпителия уже видно на 2 часа. Эксплант содержит обширную дегенерации после 24 часов. Оригинальный увеличение: 10X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Потребность в физиологически значимых моделей, на которых лечение человека слизистой кишечника может быть обоснованно испытания уже давно было подчеркнуто. Многие исследователи определили потенциальные артефактов и дефектов в обеих клеточных 5 и 6 моделей мышей до сих пор использовались для этой цели. В самом деле, хотя перспективные доклинические данные часто получены, они редко перевести на значительные клинические преимущества.
Способ, описанный в данной работе, представляет собой относительно простой, но эффективный и новые адаптации к существующим протоколам 7, 8 к культуре и стимуляции кишечника человека эксплантаты слизистой оболочки в поляризованном моды.
Эта модель могла бы дать превосходную дополнительный подход для генерации действительны доклинических данных, прежде чем принимать потенциального лечения любого вида в клиники. Таким образом, несчастный клинические исходы 9 потенциально может быть расторгнут и исследователи могли бы болеесодействие безопасно лечение в клиники для обработки острых воспалительных состояний.
Основными преимуществами модели являются возможность сравнить поляризованного по сравнению с не поляризованной стимуляции и следовать реакция ткани на протяжении 24-часового периода времени. Очень важным параметром является то, что в каждом эксперименте, различные процедуры применяются на эксплантаты из того же пациента, которое позволяет учитывать изменчивость между пациентами. Тот факт, что эксплантаты имеют относительно большие размеры по сравнению с биопсии также означает, что различные анализы могут быть выполнены на той же эксплантов, что подтверждает результаты по-разному (ИФА, количественный rtPCRs, микрочипов анализа, иммуногистохимии и / или иммунофлюоресценции данные). Кроме того, другие виды анализов могут быть оптимизированы в будущем, таких как очистка клеточных совокупностей из эксплантов стимулировал и оценки их фенотипа цитофлуориметрического анализуSIS.
Однако существуют также существенные ограничения должны быть приняты во внимание. В своем нынешнем виде эта модель не подходит для высокопроизводительного скрининга большое количество методов лечения, так как он базируется на наличии ткани. Модели культуры клеток, вероятно, более подходящие для этой цели, так как они просты в обращении и выполняют большое количество стимуляции на 10, тогда как модели мы описываем бы более эффективно использоваться в качестве конечного тестирования кандидат процедуры перед входом в клиниках. Кроме того, сроках, в течение которых нам удалось сохранить жизнеспособность тканей не позволяет экспериментов, требующих длительного мониторинга, такие как РНК-интерференции. Наконец, бактериальный стимуляция осуществляется в обычном инкубаторе и не позволяет сохранить или тестирования эффекта анаэробных бактерий. Это наше намерение работать по этим вопросам в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Эрика Милети за отличную техническую поддержку и д-р Антонио Ди Sabatino для обеспечения кислородом камер.
Финансирование: Эта работа была поддержана грантами от седьмой рамочной программы ЕС (IBDase, ERC: Dendroworld) и Фонд Cariplo к MR и поддержке Марии Кюри международной мобильности обучения сети (перекрестные помехи, соглашение о гранте №: 21553-2), чтобы KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
