Abstract
Eiwitafbraak door de ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) is een belangrijk regulerend mechanisme voor proteïne homeostase in alle eukaryoten. De standaard aanpak voor het bepalen van intracellulaire eiwitafbraak vertrouwt op biochemische assays voor het volgen van de kinetiek van eiwit daling. Dergelijke methoden zijn vaak omslachtig en tijdrovend en derhalve niet vatbaar experimenten ter beoordeling van verschillende substraten en afbraakcondities. Als alternatief hebben celgroei gebaseerde testen ontwikkeld die, in hun conventionele formaat eindpunt assays die niet kwantitatief bepalen relatieve veranderingen in eiwitniveaus.
Hier een methode die getrouw bepaalt veranderingen in eiwitafbraak tarieven koppelen ze gistcel-groeikinetiek beschrijven we. De methode is gebaseerd op een vast selectiesysteem waarbij uracil auxotrofie van URA3 -deleted gistcellen wordt gered door een exogeen reportergen expressie, Bestaande uit een fusie tussen de essentiële URA3-gen en een degradatie determinant (degron). De reporter proteïne is ontworpen zodat de synthese constant is terwijl de afbraak wordt bepaald door de degron. Zoals celgroei in uracil-deficiënt medium evenredig met de relatieve niveaus van Ura3, groeikinetiek zijn volledig afhankelijk van de reporter eiwitafbraak.
Deze methode meet nauwkeurig veranderingen in intracellulaire eiwitafbraak kinetiek. Het wordt toegepast op: (a) Bepaling van de relatieve bijdrage van bekende ubiquitine conjugeren factoren proteolyse (b) E2 conjugeren enzym structuur-functie analyse (c) de identificatie en karakterisatie van nieuwe degrons. Toepassing van de degron- URA3 gebaseerde systeem overstijgt het veld eiwitafbraak, als het kan worden aangepast aan het volgen van veranderingen van eiwitten die samenhangen met functies van andere moleculaire processen.
Introduction
De ubiquitine-proteasoom degradatie systeem is een belangrijke regulerende machine, die is betrokken bij het handhaven van homeostase eiwitten in alle eukaryoten. De UPS conjugaten eerst meerdere ubiquitine moleculen aan een doeleiwit waarna de poly-ubiquitine-gemerkt eiwit wordt afgebroken door het 26S proteasoom. In de meeste gevallen, de snelheidsbepalende stap voor ubiquitine gemedieerde afbraak beperkt is substraat ubiquitinering, gemedieerd door conjugeren van enzymen E2 en E3 ligeren enzymen (E3 ligasen) 1. Bijgevolg intracellulaire stabiliteit van eiwitten weerspiegelt hun gevoeligheid voor ubiquitine conjugatie en de activiteit van hun verwante ubiquitinering enzymen.
E3 ligases zijn de belangrijkste componenten substraat erkenning van de UPS. Als zodanig zijn deze enzymen herkennen degrons in hun substraten die ofwel afwezig of niet blootgesteld in de stal 2 tegenhangers. Bijvoorbeeld, veel regulatoren van de celcyclus must worden gesynthetiseerd en afgebroken in een tijdelijk specifieke manier om voortgang van de celcyclus in orde te houden. De afbraak van deze eiwitten wordt vaak geregeld door fosforylering-gemedieerde signaaltransductie gereguleerde kinasen 3,4. Aan de andere kant, zijn afwijkend gevouwen eiwitten herkend door cryptische degrons. Dit zijn gebieden die normaal verborgen in de natieve structuur worden blootgesteld aan structuur verstoring. Dergelijke degrons omvatten hydrofobe domeinen 5-7 en intrinsiek ontvouwen segmenten 8.
Aangezien de rudimentaire ontdekking van het ubiquitine-systeem eiwitafbraak en karakterisering van de fundamenten in reticulocyten-lysaten 9, gist genetica was instrumenteel ontdekken vele componenten van het ubiquitine systeem 10. Het succes van gist als modelorganisme voor systematische analyse van eiwitafbraak door de UPS is vooral te wijten aan het feit dat de UPS hoogly geconserveerd in alle eukaryoten 4, in combinatie met zeer geschikt zijn als een experimenteel systeem. Inderdaad, gist gebaseerde systemen algemeen gebruikt om de werkingsmechanismen van de ubiquitinering machine ontcijferen.
Studeren eiwitafbraak door biochemische middel meestal vereist voorbereiding van cel extracten. Terwijl dierlijke cel eiwitten onder relatief milde omstandigheden dat eiwit interacties en functie behouden kunnen worden geëxtraheerd, de aanwezigheid van een stevige celwand van gist 11 zijn aanmerkelijk zwaardere verstoring voorwaarden eiwit herstel kunnen beïnvloeden. Sterker nog, verschillende procedures voor gistcel verstoring verschillen aanzienlijk in hun mogelijkheden om intacte eiwitten herstellen in hoeveelheden die hun relatieve cellulaire overvloed correct voor te stellen. Verder onnauwkeurigheid is inherent aan de verschillende methoden voor het bepalen afbraaksnelheden van specifieke eiwitten: Metabolisch labelen based 'pulse-chase experimenten van gevolgd door immunoprecipitation, specifieke eiwitten 12 isoleren, is vaak niet strikt kwantitatief. Dus, als afbraak van eiwitten wordt vergeleken met deze methode, extra voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van de resultaten. Om dit nadeel te omzeilen, kan een alternatief cycloheximide (CHX) chase assay worden gebruikt 12. In deze test wordt de vertaling inhibitor toegevoegd aan celculturen en temporele veranderingen in eiwit steady-state niveaus worden vervolgens gecontroleerd. Niettemin is het gebruik van CHX beperkt tot eiwitten met relatief korte halfwaardetijden (<90 min), de inhibitie van de eiwitsynthese langdurige cytotoxisch. Met name beide bovengenoemde assays vereisen het gebruik van eiwit-specifieke antilichamen, die niet altijd beschikbaar zijn.
Om deze technische beperkingen te overwinnen, hebben de onderzoekers verschillende benaderingen die niet celextractie en directe eiwit behandeling nodig hebben ontwikkeld. Een benadering is gebaseerd op de vaststelling van auxotrofe yeast stammen, verkregen door deletie van genen die coderen voor essentiële metabole enzymen. Dergelijke genen omvatten HIS3, LEU2, LYS2 en TRP1, coderen voor enzymen die nodig zijn voor aminozuur biosynthese en URA3 dat OMP decarboxylase codeert (Ura3), een enzym van pyrimidine biosynthese ribonucleotide. Ura3 is op grote schaal gebruikt in de eiwitafbraak studies. In deze testen constitutieve expressie van Ura3 redt groei van ura3 cellen in uracil-deficiënt medium 13. Derhalve gedestabiliseerd Ura3 door de fusie van een degron kan celgroei verspilling van minimaal medium zonder uracil. Deze werkwijze is gebruikt in diverse eiwitafbraak onderzoeken, inclusief de identificatie van determinanten degradatie 5, E3 ligasen 14 en hulpstoffen ubiquitinering factoren 15 en de ontdekking van nieuwe UPS degrons 16. Al deze methoden celgroei op agarplaten als assay uitlezing. Echter, tHij groei criterium (positieve / negatieve groei), terwijl robuust en efficiënt is meestal kwalitatieve en niet kwantitatieve informatie die belangrijk is voor het evalueren potentie een degron of de relatieve bijdrage van de verschillende hulpstoffen afbraak factoren verschaffen.
We hebben daarom en gebruikt gistvectoren en selectie mogelijk systematische en kwantitatieve analyse van eiwitafbraak door de URA3 -degron fusiesysteem. Het protocol is gebaseerd op een eenvoudig te hanteren assay die Groeikinetiek meet in vloeibare kweek onder selectieve omstandigheden (Gils) en het genereren van standaard groeicurves. Gist groei kinetiek worden gekenmerkt door drie fasen - de vertraging, de exponentiële (log) en de stationaire fase. Berekening van gist replicatie kinetiek gedurende de log-fase onder selectieve omstandigheden, die wordt bepaald door de niveaus van expressie van het Ura3-degron, geeft een onbevooroordeelde kwantitatieve meting of eiwitafbraak. Deze methode kan worden toegepast voor het meten en vergelijken van afbraaksnelheden van meerdere UPS substraten gelijktijdig meerdere stammen en onder verschillende omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek
- Transformeer de geschikte auxotrofe gistcellen, zoals Try467 (tabel 2), met een plasmide dat (a) een URA3 -degron fusie en (b) een additionele metabole merker voor plasmideselectie en onderhoud.
Opmerking: Een voorbeeld van een geschikte plasmide-YDpK MET25p-° 1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dit is een gist integratief plasmide dat een fusie-eiwit omvattende ° 1 - een degron afgeleid uit de gisttranscriptiefactor. factor Mat2 17, FLAG epitoop - voor detectie door immunoblotting, Vma12 - een stabiele ER eiwit, en Ura3 15,18 (Figuur 3A). (Zie Tabel 3 voor plasmiden die in deze studie en aanvullende voorbeelden van geschikte plasmiden.) - Voor plasmideselectie onderhoud houden cellen in agarplaten onder een geschikte synthetische Defined (SD) medium zonder aminozuur selectiemerkers
- Kweek cellen O / N bij 30 ° C in een geschikt selectief medium voor SD plasmide onderhoud tot een stationaire fase is bereikt. Groeien de cellen in reageerbuizen of in een 96-well plaat, afhankelijk van het aantal te onderzoeken monsters (deel 2).
2. Cel Voorbereiding voor Analyse
- Bij een klein aantal monsters (N≤15) moeten worden getest, verdun de cellen en het medium vervangen als volgt:
- Verdun 50 pi cellen van een O / N kweek met 150 pl SD medium per putje in een 96-well plaat (heldere bodem). Let op, het eerste monster wordt aangeduid als blanco bevat medium alleen.
- Bepaal de OD 600-waarden van de monsters in de 96-well plaat met een microplaat lezer.
- Bereken de werkelijke OD 600 in elk putje van de OD 600 lezing van de verdunningsfactor (x4) te vermenigvuldigen, uit which de waarde van de blanko afgetrokken. Normaliseren van de verkregen waarden te delen door 0,55 tot een berekende padlengte van 1 cm volgens de Beer-Lambert wet verkrijgen. Merk deze waarde constant bij het meten van de OD 600 van 200 ul cellen in een standaard 96-putjesplaat.
- Bereken de exacte benodigde volume voor het verkrijgen van gistcellen in bedrag ter OD600 van 0,25 en overgebracht naar een Eppendorf buis.
- Spin down van de cellen met een hoge snelheid (12.000 xg) gedurende 1 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml van het geschikte selectieve medium (zie paragraaf 3.1) te verkrijgen OD 600 van 0,25.
- Breng 200 pi van de verdunde stammen een nieuwe put in een 96-well plaat.
- Wanneer een groot aantal monsters (N> 15) te testen, verdun de cellen en plaats het medium zonder voorafgaande OD600 metingen als volgt:
- Breng 10 pl stationaire cellengegroeid O / N in een 96-wells plaat in een nieuwe 96-well plaat met 190 pl (verdunning 1:20) van de geschikte selectieve media (zie paragraaf 3.1).
3. Groei Kinetics in Liquid Culture onder Selectief Voorwaarden (Gils)
- Gebruik de volgende media voor groei metingen met behulp van de Ura3-degron reporter:
- Voor de positieve controles van groei gist onder niet-beperkende voorwaarden, gebruik plasmide selectieve SD media (zie paragraaf 1.2). Indien geen plasmideselectie vereist, bijvoorbeeld bij gebruik van een integratieve plasmide zoals ° 1 -UV, SD medium dat alle benodigde aminozuren (SD volledig) worden gebruikt.
- Voor experimentele monsters meten groei onder beperkende voorwaarden, gebruik maken van SD-URA medium.
- Stel een multimode microplaat lezer. Een incubatietemperatuur van 30 ° C, OD 600 meetintervallen van 15 min, en een orbitaal schudden en lineaire cycli van 1 min zeven min <br /> OPMERKING: Deze dual-mode schudden werd geoptimaliseerd om een homogene verdeling van de cellen te verkrijgen; kunnen evenwel ook andere schudden modes of zelfs geen schudden zo goed werkt.
- Incubeer de cellen bij 30 ° C in een microplaat reader O / N of totdat de cellen de stationaire fase (12-24 uur) bereikt.
- De ruwe data te exporteren naar een spreadsheet-bestand.
- Bepaal gist groeikinetiek behulp MDTcalc, een aangepaste software-programma dat de minimale tijd berekent (in uur) voor de cellen om hun bevolkingsomvang verdubbelen (Minimal Verdubbeling Time (MDT), voor meer informatie zie hoofdstuk 4).
4. Berekening van de Minimal Verdubbeling Time (MDT): Principes van de MDTcalc Algorithm
OPMERKING: Principes van het MDTcalc algoritme, met een representatief monster van Try467 gistcellen (tabel 2) gekweekt in SD compleet medium, worden weergegeven in tabel 1 en figuur 1, die een data spreadsheet en groei plots, respectief.
- Aftrekken OD 600 blanco waarden verkregen in de desbetreffende holte van elk van de verkregen in de monsterhouder metingen. Verdeel de resulterende verschillen met 0,55 (96-well platen) te corrigeren voor de lengte lichtweg. Zet de eindwaarden (tabel 1, Trans.) Tegen de tijd om de werkelijke gist groeicurve (OD 600 / hr) (Figuur 1A) produceren.
- Bereken log 2 (OD 600) voor elk van de getransformeerde waarden van de logaritmische groeifase te zetten in een lineaire curve (Figuur 1B).
- Bereken de helling van 10 tijdstippen interval (N = 10) begint op tijdstip 0 en één tijdpunt bewegen in tot N <10 (tabel 1, Slope Figuur 1C).
- Bereken de inverse waarde van elke helling naar de tijd die de celpopulatie verdubbelen verkrijgen (tabel 1, 1 / Slope Figuur 1C). Bereken de minimale1 / Helling waarde voor de MDT (Figuur 1C Tabel 1, zwarte rechthoek) te bepalen. Extraheer de berekende MDT van cellen in het monster (Tabel 1, 1 / Helling, zwarte rechthoek) vanaf het geselecteerde tijdsinterval (Tabel 1, door rode rechthoek geschetst, Figuren 1B, 1D).
OPMERKING: De snelheid van celgroei op SD-URA medium is omgekeerd evenredig met de MDT.
5. Met behulp van MDTcalc
- Kopieer de aangevulde programma bestanden in een opgegeven map op de computer.
- Zorg ervoor dat de spreadsheet-bestand met de groei van data wordt opgeslagen en gesloten. Open het MDTcalc applicatieprogramma aan de start verschijnt zien.
- Plaats de benodigde informatie, zoals getoond in Figuur 2:
- Onder 'Bestand pad', klikt u op de rechthoek aan de rechterkant om de spreadsheet bestand te zoeken.
- Onder 'Vel naam', schrijf de naam spreadsheet waar thij ruwe data zich bevindt.
- Onder 'Uitgangspositie', steekt u de spreadsheet-coördinaat van de tijd 0 van het eerste monster.
- Onder 'Time column', plaatst de brief het definiëren van de locatie van het tijdstip kolom (tijd moet worden voorzien in seconden).
- Onder "lege kolom, plaatst de letter definieert de locatie van de lege kolom (meestal, maar niet noodzakelijk in goede A1 van de 96-well plaat).
- Onder 'OD-waarde', kies de minimale getransformeerd OD 600 waarde die nodig is voor de start van de MDT-berekening (meestal 0,15-0,25). Stel deze waarde in voorkomt berekeningen van MDT voor culturen in lag-fase als gevolg van overmatige verdunning zodat MDT wordt alleen berekend voor monsters die de gedefinieerde OD 600 waarde of hoger bereiken.
- Zodra de laatste waarde is ingevoerd, drukt u op de 'berekenen' knop aan de onderkant van het scherm. Zorg ervoor dat de voortgangsbalk op de rechter verandert geleidelijk te green. Gebruik de spreadsheet bestand niet openen tijdens het rekenproces.
- De twee reeksen gegevens die automatisch op het scherm bij het voltooien van de MDT berekening in een spreadsheet exporteren. Zorg ervoor dat de gegevens bevat: (a) de MDT waarde voor elk goed dat de minimale OD-waarde test (zoals vermeld in paragraaf 5.2.1.6) en (b) de oorspronkelijke tijdstip van het interval waaruit de MDT werd berekend passeert (Start tijd).
- Plaats de benodigde informatie, zoals getoond in Figuur 2:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onderzoeken de rol van enzymen van de Doa10 route in de afbraak van een reporter substraat
Om de geldigheid van de GILS werkwijze werd vergeleken met een traditionele degradatie assay te testen. Dit experiment evalueert de relatieve bijdrage van componenten van de ER-membraan gelokaliseerde Doa10 E3-ligase complex 20,21 de afbraak van het eiwit kwaliteitscontrole reporter substraat Deg1- VU (Figuur 3A). De Deg1- VU plasmide geïntegreerd in wild type cellen of in cellen die het gen voor het enzym E2 conjugeren, werd UBC7 (ubc7) en proteïne stabiliteit vervolgens bepaald door CHX chase assay 6. Anti-FLAG immunoblotting onthulde een stabiel ° 1 -VU eiwit band in ubc7 cellen die afwezig is in wild type cellen (Figuur 3B) was. De afwezigheid van ° 1 -VU in wild-type cellen is toewijsbaarted haar continue afbraak die werd afgeschaft ubc7 cellen, wat aangeeft dat ° 1 -VU stabiliteit sterk afhankelijk Ubc7.
Uiteraard, de afbraak van Deg1- VU is snel. Echter, de relatieve afbraaksnelheid niet bepaald door een CHX assay omdat het eiwit detecteerbaar in wildtype cellen vanaf het begin. Bijgevolg werd de nieuw ontwikkelde Gils testwerkwijze gebruikt, teneinde de relatieve verschillen in de kinetiek van eiwitafbraak tussen wild-type en diverse mutante stammen (figuur 3C) te vergelijken. Aanvankelijk, wild type, ubc6, ubc7 of doa10 cellen die ° 1 -VU werden gekweekt op SD compleet medium. Om Gils meten, werden de cellen gewassen en geïncubeerd in SD-URA. MDT berekening werd uitgevoerd zoals toegelicht in het protocol. Figuren 3C, 3D vertonen gelijkaardige groeicurven en berekende MDT (~ 2,5 uur) voor alle stammen gegroeid in SD compleet, excluding de mogelijkheid dat de deletie van één van de onderzochte genen beïnvloedt celgroei. Daarentegen incubatie SD-URA resulteerde in slechte groei van wildtype cellen (MDT = 6.34), terwijl slechts een geringe toename defect waargenomen in de mutante stammen (MDT ~ 3 uur).
Onderzoeken van het effect van verschillende mutanten van het enzym E2 conjugeren Ubc7 op de afbraak van Deg1- VU
Dat Ubc7 absoluut vereist voor Deg1- VU afbraak maakt een nauwkeurige evaluatie ook gedeeltelijke effecten van verschillende E2 mutanten, omdat het experimentele bereik van het systeem is zeer breed. Dienovereenkomstig, plasmiden die wild-type of mutant UBC7 werden geïntegreerd in Ubc7 cellen die ° 1 -VU en hun bijdrage aan de afbraak werd bepaald door Gils. Zoals verwacht werden snel groeikinetiek waargenomen in cellen die Ubc7 met de actieve plaats mutants C89S en N81A 22 (figuur 4). Bovendien, twee mutanten voorspeld indirect belemmeren ° 1 -VU afbraak (V25G en H94K) getest. Deze mutaties ook verhoogde celgroei, vergeleken met wildtype Ubc7, zij het in mindere mate dan de actieve plaats mutanten (gemiddeld MDTs van 3,4 uur voor V25G en H94K vergeleken met de gemiddelde MDTs 2,7 uur voor C89S en N81K) (Figuur 4 ). Aldus kan de gils werkwijze worden toegepast voor nauwkeurige meting van de relatieve bijdrage van verschillende degradatie factoren de stabiliteit van een reporter substraat.
Isolatie en evaluatie van nieuwe degrons
Het gils systeem werd ook gebruikt in high throughput beeldformaat om nieuwe degrons identificeren en kwantificeren van de relatieve sterkte, dat wil zeggen de mate waarin zij afbraak veroorzaken (figuur 5). Om de identificatie van bonafide degrons optimaliseren, een extraselectiestap, die de groei in aanwezigheid van fluororotinezuur (5-FOA), werd toegevoegd. Ura3 efficiënte wijze 5-FOA een toxische verbinding (5-fluorouracil) die kan dienen als een positieve selectie voor het isoleren van giststammen waarin Ura3 wordt gedestabiliseerd 16,23. Om nieuwe degrons identificeren, een bibliotheek van reporter plasmiden werd gegenereerd door het fuseren van willekeurige fragmenten verkregen uit een cDNA-bibliotheek voor gist Ura3-GFP plasmide 24 (figuur 5A). Het GFP-groep werd toegevoegd om een tweede scherm in te schakelen en geven informatie over de lokalisatie van de fusie degron (zie bespreking). De bibliotheek werd getransformeerd in gist, vervolgens geselecteerd in de aanwezigheid van 5-FOA (figuur 5B) en positieve klonen werden geïsoleerd en opnieuw gezaaid op agarplaten in een 96-well plaat formaat. Elke kolonie werd overgebracht naar 96-well plaat geïncubeerd O / N en verdund in een nieuwe 96-well plaat zoals beschreven in paragraaf 2.2. Verwacht wordt dat de groei van cellen in SD-URA mediumcorreleren met de mate van expressie Ura3, dat het resultaat is van de potentie degron om afbraak te induceren. Dit werd later bevestigd door het toepassen van Gils (figuur 5C). We bevestigden dat alle willekeurig geplukt kolonies die werden vooraf geselecteerd met 5-FOA toonde vergelijkbare MDT waarden, op SD-LEU medium (Figuur 5C, lege bars). Daarentegen alle klonen vertoonden variabele groei op SD-URA, die aanzienlijk langzamer dan cellen die control Ura3-GFP (gegevens niet getoond) waren. Zoals aangegeven, is er een omgekeerd verband tussen groei op SD-URA en MDT. Dus hoe hoger de MDT, het krachtiger is degron. Inderdaad, alle MDTs afgeleid van positief geselecteerde klonen waren hoger dan die van de controle (boven de rode lijn) (Figuur 5C, gevulde staven).
<strong> Tabel 1. Illustratie van de berekening van de gist MDT. Tijd units zijn uren (hr). Blank en monster zijn van OD 600 leest. Transformatie (Trans.) is de OD 600 waarde na blanco aftrekken en weglengte correctie. Inloggen 2 wordt berekend uit de getransformeerde gegevens. Slope de Log 2 (OD600) waarden binnen opeenvolgende intervallen van 10 tijdstippen gedeeld door tijd. 1 / Slope de tijd die de celpopulatie zich dupliceren. zwarte rechthoek markeert de MDT waarde. Red rechthoek markeert het tijdsinterval waarop de MDT berekend.
| Gist | Genotype | Bron |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | Euroscarf |
| TRy508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-° 1-vlag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Deze studie |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-° 1-vlag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Deze studie |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-° 1-vlag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Deze studie |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-° 1-vlag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Deze studie |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: pRS303 :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-° 1-vlag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Deze studie |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-° 1-vlag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | Deze studie |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-° 1-vlag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Deze studie |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-° 1-vlag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | Deze studie |
Tabel 2 Lijst van giststammen gebruikt in deze studie.
| Plasmiden gebruikt in deze studie | ||
| Plasmide | Relevante markers | Bron |
| pTR717 | YDpK-MET25p-° 1-vlag-Vma12-Ura3 (integratieve plasmide dat LYS1) | Deze studie |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | Deze studie |
| Additionele geschikte reporter plasmiden | ||
| Plasmide | Relevante markers | Bron |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Lewis en Pelham |
Tabel 3. Lijst van plasmiden die in deze studie Reference:.. Lewis, MJ & Pelham, HR inefficiënte kwaliteitscontrole van warmtegevoelige eiwitten op het plasmamembraan PLoS One 4, e5038, doi: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Figuur 1. Beginselen van de berekening van de MDT. Try467 gistcellen bij OD 600 0,22, werden in SD volledige media gedurende de vermelde periode. OD600 metingen werden elk ~ 15 min en de gegevens werden verzameld in een spreadsheet. (A) Getransformeerde OD600 waarden uit Tabel 1 uitgezet tegen de tijd. (B)Log 2 van OD 600 uitgezet tegen de tijd Rode lijn:. Markeert het tijdsinterval van waaruit de MDT werd berekend (D). (C) Gist groeipercentage (helling) werd berekend door het meten van veranderingen in de OD 600 van opeenvolgende 10 tijdstippen (uitgaande van lineariteit) na verloop van tijd Starttijd:. Het tijdstip vanaf wanneer de berekening werd geïnitieerd. (D) De duur van gist te verdubbelen is de inverse van de helling van (C) (1 / helling) MDT. De berekende minimale verdubbelingstijd (in uur).
Figuur 2. MDTcalc startscherm: Protocol paragraaf 5.1. Typische ingang waarden te worden ingevoerd, worden weergegeven.
Figuur 4. Het meten van relatieve afbraaksnelheid van ° 1 -VU in Ubc7 mutantstammen Links:. Plot van de getransformeerde OD 600 waarden, gemeten tijdens de replicatie van w ild-type, ubc7 Δ en de aangegeven Ubc7 mutanten, uitgezet tegen de tijd. Cellen die ° 1 -VU werden gekweekt op SD-URA medium en OD 600 werd gemeten elke ~ 15 min. Rechts: De MDT voor elke stam werd berekend met behulp van MDTcalc.
1 / 52021fig5highres.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 5. Een hoge doorvoer assay voor de identificatie en isolatie van nieuw degrons. (A) Schematische voorstelling van de kenmerken van de Ura3-GFP-cDNA reporter. (B) een stroomdiagram de experimentele stappen voor de isolatie van giststammen die een degron. Het plasmide bibliotheek in A beschreven werd omgevormd tot Try467 cellen, gevolgd door selectie op SD-LEU platen. Kolonies werden gerepliceerd naar SD-LEU-platen die 5-FOA en snel groeiende kolonies werden verzameld en georganiseerd op platen in een geordende array. (C) Kolonies expressie Ura3-GFP-cDNA die groeiden op platen die 5-FOA werden geïncubeerd in ofwel SD-LEU of SD-URA medium gedurende 20 uur. OD 600 werd gemeten om ~ 15 min en de minimale gist verdubbelingstijd (MDT) werd berekend met de MDTcalc Neen degron:. Een plasmide dat Ura3-GFP zonder degron, dient als een positieve controle voor growth Rode lijn:. drempel bepaald door de MDT waarde van de controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een test op basis van de celgroei voor het bepalen van de relatieve eiwitafbraak prijzen, genoemd 'Groeikinetiek in Liquid cultuur onder Selectief omstandigheden' (Gils). De Gils assay heeft een aantal voordelen: Het is eenvoudig in te stellen, data-acquisitie en analyse is eenvoudig en het is uiterst modulair. Bijgevolg kan gils gelijktijdig uitgeoefend op meerdere monsters in een gebruiksvriendelijke multi-well plaat formaat dat kan worden aangepast aan automatisering voor high throughput toepassingen. Belangrijker, gils geeft hoog reproduceerbare, kwantitatieve en betrouwbare gegevens en flexibeler is dan agar-plaat gebaseerde groei assays die selecteren op positieve / negatieve groei. Daarnaast Gils is zeer gevoelig in dat kleine variaties in eiwitafbraak tarieven of steady-state niveaus kan detecteren, als gevolg van de activiteit van de bijbehorende UPS componenten of degrons. Tenslotte gils assays vereisen aanzienlijk kortere groei (<12 uur) in vergelijking met growth assays op agarplaten (gewoonlijk 2-4 dagen).
Terwijl de GILS test is zeer nuttig voor het bestuderen van eiwitafbraak, moet een aantal belangrijke overwegingen in aanmerking worden genomen. Bijvoorbeeld, is het essentieel om een isogene giststam achtergrond gebruiken vanwege stamspecifieke groeikenmerken. Bovendien geldigheid assay gaan elk bepaling worden minstens drie maal onder dezelfde omstandigheden herhaald, belangrijker, de initiële celdichtheid (OD600), groeitemperatuur en celkweek schudden intensiteit mag niet worden veranderd. Het wordt daarom aanbevolen dat de specifieke assay protocol wordt opgeslagen in de software van de microplaataflezer voor herhaald gebruik. Een extra variabele die moeten worden overwogen wanneer het degron is gepositioneerd binnen Ura3. Zoals de degron positie zijn functie kan bepalen, positioneren op ofwel de C 'of N' regio's moeten empirisch worden getoetst.
Kalibratie van reporter protein expressie niveau is ook van cruciaal belang voor de succesvolle toepassing van Gils. Een optimale reporter is één die efficiënter wordt afgebroken door het systeem onderzochte en verleent derhalve uracil auxotrofie. Variaties in auxotrofie ook getrouw weerspiegelen de reporter stabiliteit. Dit kan empirisch worden bepaald door voorafgaande testen van de correlatie tussen reporter eiwitafbraak tarieven, vastgesteld door aanvullende biochemische methoden, en MDT waarden, bepaald door Gils (Figuur 3B). Er probleem ontstaat wanneer de basale steady-state expressie van een reporter geen drempelniveau bereiken en dus te laag om groei SD-URA zelfs wanneer deze volledig wordt gestabiliseerd mogelijk. Een dergelijk probleem kan worden ondervangen door het plaatsen van de reporter expressie onder controle van een induceerbare promoter die basale eiwitexpressie verhoogt zonder dat degradatie. Promotor activiteit in dergelijke systemen moet de fijnafstelling worden gekalibreerd om blijvende groei op SD-URA te voorkomen als gevolg van high eiwitniveaus en reporter enzymactiviteit zelfs wanneer het gedeeltelijk afgebroken. De promotoren en expressie voorwaarden beschreven in deze studie werden gekozen omdat ze alleen gevoelig regulatie van eiwitexpressie: MET25p en CUP1 p-metaboliet geïnduceerde promoters waarvan de activiteit afgestemd kunnen worden door besturing van methionine en koper respectievelijk (Tabel 3).
Kwaliteitscontrole reporter substraten (als die in deze studie beschreven) kan intracellulaire aggregaten die kunnen afzonderen Ura3 en zijn functie te voorkomen vormen. In dat geval kan uracil auxotrofie onrechte worden geïnterpreteerd als het resultaat van eiwitafbraak. De neiging van verschillende degrons testen te aggregeren, een extra reporter worden toegepast. Bijvoorbeeld, het Ura3-GFP reporter ontworpen voor degron (Figuur 5A), maakt visualisatie van intracellulaire aggregaten door fluorescentiemicroscopie van cellen groeien in de preseNVU van 5-FOA. Deze aggregaten verschijnen als dichte GFP foci die duidelijk onderscheiden van de diffuse weergave van het oplosbare eiwit (gegevens niet getoond). De Ura3-GFP-reporter degron kunnen eveneens worden gebruikt om het effect van de degron op proteïne co-lokalisatie en subcellulaire distributie bepalen. Het kan ook worden gebruikt voor het volgen van de afbraak van geselecteerde substraten door flowcytometrie, als tweede scherm 25.
Een zeer belangrijk voordeel van de GILS werkwijze is dat deze voldoende flexibel en kan dus gemakkelijk worden aangepast aan verschillende toepassingen naast die welke in dit document beschreven. Bijvoorbeeld kan de werkwijze ook worden gebruikt voor het onderzoeken van de geschiktheid van het proteasoom onder verschillende omstandigheden. In dit geval, een niet-ubiquitylated proteasoom substraat zoals ornithine decarboxylase (ODC) is gefuseerd aan Ura3. De werkwijze kan ook eiwitafbraak testen in verschillende intracellulaire compartimenten wanneer een specifieke lokalisatie signaal wordt toegepast.In deze studie verankerd Vma12 de reporter aan de ER-membraan (figuren 3, 4). Evenzo kan een nucleair lokalisatie signaal (NLS), ER retentie signaal (KDEL) of cytosol (afwezigheid van een specifiek signaal) worden gebruikt. Een systeem waarmee gelijktijdige analyse van de afbraak van eiwitten in verschillende intracellulaire compartimenten kunnen grote invloed hebben op ons begrip van hoe eiwitafbraak netwerken opereren hebben. Tenslotte kunnen de beginselen van de selectiemethode toegepast onderzoek van eiwitafbraak in andere model celgebaseerde systemen van bacteriën menselijke cellen, die allemaal afhankelijk het URA3 gen product te overleven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A.
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
