نموذج قائم على خلية المشيمية الضفيرة طلائي من الجدار السائل الإنسان الدم النخاعي لدراسة العدوى البكتيرية من الجانب Basolateral
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
حاجز السوائل الدم النخاعي (BCSFB) هي واحدة من المواقع حاجز الثلاثة بين الدم والدماغ 1. في المضاهاة الصرفي هي الخلايا الظهارية في الضفيرة المشيمية (CP) 2،3، وهو ملفوف-البطانية الظهارية، وهي أوعية دموية بشدة وتقع في بطينات الدماغ. يقدم CP لإنتاج السائل النخاعي (CSF)، وكذلك لفصل الأخير من الدم. من أجل تحقيق وظيفة الحاجز، تظهر الخلايا الظهارية CP نشاط احتسائية منخفضة، وتعبر عن النقل محددة، وترتبط كثيفة من قبل شبكة مستمرة من منعطفات ضيقة (TJS) 2،3.
البشري الورم الحليمي المشيمية الضفيرة (HIBCPP) الخلايا، مستمدة من خبيث الورم الحليمي المشيمية الضفيرة من امرأة يابانية 4 استخدمت لبناء وظيفي في نموذج المختبر من BCSFB. تظهر خلايا HIBCPP بضع خصائص BCSFB ظيفية وتشكيل TJجدائل، وتطوير إمكانات غشاء بطريق الظهارة العالية التي يمكن تحديدها على النحو المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير)، والنفاذية طفيفة عن الجزيئات. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا HIBCPP تعبر عن النقل المميزة، والتي قد تساعد على تنظيم المكروية الأيونية، وتبين قمي / basolateral 5،6،7 القطبية.
وقد تبين أن BCSFB للعمل كموقع لدخول مسببات الأمراض (البكتيريا والفيروسات والفطريات) في الجهاز العصبي المركزي (CNS) 8. غزو الجراثيم، بما في ذلك النيسرية السحائية (السحائية ن)، وهي بكتيريا سالبة الجرام، يمكن أن يسبب الأمراض الحادة مثل الالتهاب السحائي. دليل على أنه يتغلب على حاجز الظهارية واقية من CP معتمد من قبل الملاحظات التشريحية المرضية في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب السحايا اظهار زيادة كميات المكورات السحائية في الأوعية والخلايا الظهارية CP 9،10. للدخول إلى الخلايا المضيفة باcteria في كثير من الأحيان اختطاف آليات endocytotic، التي تتوسط أو الناجمة عن مستقبلات سطح محددة تقع على الخلايا المضيفة. منذ التفاعلات مسببات الأمراض مع هذه المستقبلات يمكن أن يكون نوعا نماذج محددة 11، الحيوان لا يمكن إلا أن يتم التشاور إلى حد المقيد. يوفر خط الخلية HIBCPP الفرصة لدراسة عملية الغزو، فضلا عن الآليات الجزيئية الكامنة في نظام نموذجي البشري. توظيف إدراج خلية ثقافة تمكننا من تحليل التفاعلات من مسببات الأمراض مع الخلايا المضيفة من الجانبين خلية متميزة. العديد من أنواع البكتيريا، بما في ذلك N. السحائية، تخضع بقوة لتأثير الجاذبية خلال فحوصات العدوى. للتفاعل الأمثل من مسببات الأمراض مع الخلايا HIBCPP خلال فحوصات، تضاف البكتيريا في البداية في المقصورة العليا من نظام إدراج مرشح زراعة الخلايا. لتمكين العدوى من قمية أو الجانب خلية basolateral، على التوالي، وكان شكلان للنظام في المختبر تهتblished: في نظام موحد هي المصنفة خلايا HIBCPP في المقصورة العليا من إدراج مرشح، ومحاكاة الوضع عندما تقع الكائنات الحية الدقيقة على الجانب CSF والحصول على اتصال مع الجانب قمية من الخلايا (الشكل 1A، C). في المقابل، وذلك باستخدام خلايا HIBCPP في ثقافة خلية نظام إدراج مرشح مقلوب يعكس الظروف عندما البكتيريا دخلت مجرى الدم. الكائنات الحية الدقيقة تنشر في الدم وCP قاء الخلايا الظهارية من الجانب basolateral (الشكل 1B، D). الجدير بالذكر، في هذا النظام النموذجي فقد تبين أن البكتيريا تغزو خلايا HIBCPP بطريقة القطبي تحديدا من 5،7 الجانب خلية basolateral.
في وقت لاحق للإصابة من حزب المحافظين، ومسببات الأمراض غزت يمكن التعرف عليه بواسطة النظام الفطري المناعي من خلال ربط لمستقبلات التعرف على نمط (PRRs). أعضاء موصوفة وصفا جيدا للPRRs تنتمي إلى عائلة تول مثل مستقبلات (TLR). يمكن TLRs بند الهياكل مميزة من الكائنات الحية الدقيقة المعدية، التي توصف بأنها أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs). ربط من المستقبلات يؤدي إلى تنشيط الخلية المضيفة مما يشير إلى الشلالات التي تؤدي تعبير عن السيتوكينات و chemokines 12، والتي بدورها تحفز هجرة الخلايا المناعية عبر BCSFB 13،14. ولقد ثبت أن الخلايا HIBCPP تعبر عن عدة TLRs على مستوى مرنا وأن الإصابة بفيروس N. ينتج التهاب السحايا في إفراز السيتوكينات عدة و chemokines، بما في ذلك CXCL1-3، IL6، IL8 وTNFα 15،16.
هنا، نحن تصف زراعة وإصابة خط الخلية البشرية HIBCPP في نظام إدراج الثقافة خلية المقلوب الذي يحاكي BCSFB. ويتيح هذا النظام النموذجي لدراسة التفاعلات من مسببات الأمراض مع الجانب خلية في الجسم الحي basolateral ذات الصلة فضلا عن الاستجابة الخلوية لاحقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا الظهارية للCP تشكل BCSFB الذي يفصل بين السائل النخاعي من 2،3 الدم. أنشأنا مؤخرا خط الخلية HIBCPP كنموذج البشري الوظيفي للBCSFB. الخلايا عرض وظائف حاجز مهمة من BCSFB في المختبر، بما في ذلك تطوير إمكانات غشاء عالية، ونفاذية منخفضة عن الجزيئات، وكذلك وجود خيوط مس?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
Referências
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus – a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N’Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
