Um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da Barreira Fluid Human Blood-cefalorraquidiano para o Estudo de infecção bacteriana do lado basolateral

Summary

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Abstract

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

Introduction

A barreira de fluido cerebrospinal de sangue (BCSFB) é um dos três locais de barreira entre o sangue e o cérebro ^um. Seu correlato morfológicas são as células epiteliais do plexo coróide (CP) ^{de 2,3,} um convoluta-endotelial epitelial, que é fortemente vascularizado e localizado nos ventrículos do cérebro. A CP serve para produzir o fluido cerebrospinal (CSF), bem como para separar o último do sangue. A fim de conseguir a função de barreira, as células epiteliais CP mostram uma actividade pinocitótica baixo, expressar transportadores específicos, e estão densamente ligadas por uma rede contínua de junções apertadas (TJS) ^2,3.

Células do plexo coróide do papiloma humano (HIBCPP), derivados a partir de um plexo coróide do papiloma maligno de uma japonesa ^4, foram utilizados para construir um modelo funcional em vitro da BCSFB. HIBCPP células mostram um par de características de um BCSFB funcional, tal como a formação de TJfios, o desenvolvimento de um potencial de membrana transepitelial alta que pode ser determinado como a resistência eléctrica transepitelial (TEER), e permeabilidades menores para macromoléculas. Além disso, as células HIBCPP expressar transportadores característicos, que podem servir para regular o micro ambiente iónico, e mostram apical / basolateral ^5,6,7 polaridade.

O BCSFB foi mostrado funcionar como um local de entrada para agentes patogénicos (bactérias, vírus, e fungos) no sistema nervoso central (SNC) ^8. A invasão de agentes patogénicos, incluindo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), uma bactéria Gram-negativa, podem causar doenças graves, como a meningite. A prova de que ele ultrapassa a barreira epitelial de protecção do CP é suportado por observações histopatológicas em pacientes com doença meningocócica exibindo aumento da quantidade de meningococos nos vasos e as células epiteliais ^9,10 CP. Para ganhar a entrada em células hospedeiras bacteria muitas vezes mecanismos de endocitose sequestrar, que são mediados ou desencadeada pelos receptores de superfície específicos localizados nas células hospedeiras. Uma vez que as interacções dos agentes patogénicos com estes receptores pode ser espécies modelos ^11, específicos dos animais só pode ser consultado em medida restrita. A linha celular HIBCPP proporciona a oportunidade de estudar o processo de invasão, bem como os mecanismos moleculares subjacentes em um sistema modelo humano. Empregando inserções de cultura de células nos permite analisar as interacções dos agentes patogénicos com células hospedeiras de dois lados celulares distintas. Muitas bactérias, incluindo N. meningitidis, são fortemente sujeito ao impacto da gravidade durante ensaios de infecção. Para optimizar a interacção dos agentes patogénicos com as células HIBCPP durante os ensaios, as bactérias são inicialmente adicionado para dentro do compartimento superior do sistema de cartucho filtrante de cultura de células. Para permitir que a infecção do lado apical ou do lado basolateral da célula, respectivamente, duas variações do sistema de vitro têm sido ESTAestabe-: No sistema standard HIBCPP células são semeadas para dentro do compartimento superior do elemento filtrante, simulando a situação quando os microrganismos estão localizados no lado-CSF a e entrar em contacto com o lado apical das células (Figura 1 A, C). Em contraste, usando as células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de células de filtro invertido reflecte as condições quando as bactérias tenham entrado no fluxo sanguíneo. Microorganismos difundir no sangue e encontro CP células epiteliais do lado basolateral (Figura 1B e D). Digno de nota, neste sistema modelo, foi demonstrado que as bactérias invadem as células HIBCPP numa forma polar especificamente de ^5,7 lado basolateral da célula.

Subsequentemente à infecção do CP, os agentes patogénicos podem ser invadidos reconhecido pelo sistema imune inato através de ligação a receptores de reconhecimento de padrões (SRRS). membros bem descritas de PRRS pertencem à família dos receptores de tipo Toll (TLR). pode TLRs bind para estruturas características de microorganismos infecciosos, que são padrões moleculares associados a agentes patogénicos denominado (PAMPs). A ligação dos receptores leva à activação da célula hospedeira cascatas de sinalização que provocam a expressão de citocinas e quimiocinas ^12, que por sua vez estimulam a transmigração de células imunes em todo o BCSFB ^13,14. Tem sido demonstrado que as células HIBCPP expressar vários TLRs ao nível do mRNA e que a infecção com N. meningitidis resulta na secreção de várias citocinas e quimiocinas, incluindo CXCL1-3, IL6, IL8 e TNFa ^15,16.

Aqui, nós descrevemos o cultivo e infecção da linha celular humana HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertido que imita o BCSFB. Este sistema modelo permite estudar as interacções dos agentes patogénicos com o lado da célula in vivo, relevante basolateral, bem como a subsequente resposta celular.

Protocol

1. Prepare Cultura celular filtro Incorporações nas células Sementeira HIBCPP em um sistema invertido Modelo Pré-aquecido DMEM / F12 (HAM) suplementado com 5 ug / ml de insulina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de vitelo (FCS). Use fórceps estéreis para colocar 0,33 cm² inserções de filtro de cultura de células da área de crescimento com um tamanho de poro de 3 um de cabeça para baixo em uma placa de 12 poços (Figura 1E). </li…

Representative Results

Aqui, descrevemos a cultura e infecção das células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertida. Este modelo nos permite estudar os mecanismos de invasão e as vias de sinalização molecular subjacente a partir do lado da célula basolateral, reproduzindo uma situação fisiológica de bactérias divulgação e entrar nas células epiteliais através da corrente sanguínea (Figura 1). A…

Discussion

As células epiteliais do CP formar o BCSFB que separa o CSF a partir do sangue ^2,3. Recentemente, estabeleceu a linha de células HIBCPP como um modelo humano funcional do BCSFB. As células apresentam funções de barreira importantes da BCSFB in vitro, incluindo o desenvolvimento de um potencial de membrana elevada, uma baixa permeabilidade de macromoléculas, bem como a presença de filamentos contínuos de TJs ^5. As proteínas TJ contribuir para uma polaridade apical / basolateral das…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Life Technologies	D1306
12-well plates	Starlab	CC7682-7512
24-well plates	Starlab	CC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMP			This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)	Invitrogen	A21441
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)	Invitrogen	A21442
Alexa Fluor 660 Phalloidin	Invitrogen	A22285
Bovine serum albumine (BSA)	Calbiochem	12659
Chocolate agar plates	Biomerieux	43109
Cytochalasin D	Sigma	C8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES	Gibco	31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred	Gibco	11039-047
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Fetal calf serum (FCS)	Life Technologies	10270106
FITC-Inulin	Sigma	F3272
Insulin	Sigma	19278
MgCl2	Sigma	2393
NaHCO3	Sigma	55761
PBS + Mg +Ca	Gibco	14040-174
Penicillin/Streptomycin	MP Biomedicals	1670049
Polyvitex	Biomerieux	55651
Proteose peptone	BD	211684
Serum-free medium	Gibco	10902-096
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm	Greiner	662630
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma	T8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode	Millipore	MERSSTX00