Сосудистом сплетении эпителиальных клеток на основе модели крови человека-спинномозговой жидкости барьер для изучения бактериальной инфекции от базолатеральной стороны
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
Барьер жидкость кроваво-спинномозговой (BCSFB) является одним из трех барьерных участков между кровью и мозгом 1. Его морфологический коррелят являются эпителиальные клетки сосудистое сплетение (CP) 2,3, эндотелиальный-эпителиальной гофр, который сильно развитую сосудистую сеть и находится в желудочках головного мозга. CP служит для получения цереброспинальной жидкости (CSF), а также для отделения последнего из крови. Для достижения барьерной функции, СР эпителиальные клетки показывают низкую активность pinocytotic, выражают специфические транспортеров, и плотно связаны непрерывной сетью плотных контактов (TJS) 2,3.
Человеческого хориоидпапиллома (HIBCPP) клетки, полученные из злокачественной хориоидпапиллома японской женщины 4, были использованы для построения функционала в пробирке модели BCSFB. HIBCPP клетки показывают пару характеристик функционального BCSFB как образование TJпрядей, развитие высокой трансэпителиальной мембранного потенциала, который может быть определен в качестве трансэпителиальная электрического сопротивления (TEER), а также незначительные проницаемостей для макромолекул. Кроме того, HIBCPP клетки экспрессируют характерные транспортеров, которые могут служить для регулирования ионной микросреду, и показать апикальной / базолатеральная полярности 5,6,7.
BCSFB было показано , использовался в качестве сайта входа для болезнетворных микроорганизмов (бактерий, вирусов и грибов) в центральную нервную систему (ЦНС) 8. Вторжение патогенных микроорганизмов, в том числе менингококк (N.meningitidis , ), грамотрицательные бактерии, может вызвать серьезные заболевания , как менингит. Доказательства того, что он преодолевает защитный барьер эпителиальные СР поддерживается гистопатологических наблюдений у больных с менингококк экспонирование повышенное количество менингококков в сосудах и CP эпителиальных клеток 9,10. Для того, чтобы получить вход в клетки-хозяева баcteria часто угон эндоцитозного механизмы, которые опосредованы или по заданным поверхностными рецепторами, расположенными на клетках-хозяевах. Так как взаимодействия патогенов с этими рецепторами , могут быть виды конкретных моделей 11, животных можно обратиться лишь в ограниченной степени. Клеточная линия HIBCPP дает возможность изучить процесс вторжения, а также лежащие в основе молекулярных механизмов в модельной системе человека. Использование клеточных культур вставок позволяет анализировать взаимодействия патогенов с клетками-хозяевами из двух разных сторон клеток. Многие бактерии, в том числе Н. менингита, сильно подвержены воздействию силы тяжести во время анализов инфекции. Для оптимального взаимодействия патогенов с клетками HIBCPP в ходе теста, бактерии сначала добавлены в верхний отсек системы фильтрующего элемента клеточной культуры. Чтобы включить инфекцию от апикальной или базолатеральной стороне клеток, соответственно, два варианта системы в пробирке был Эстащающие: В стандартной системе HIBCPP клетки высевают в верхний отсек вставки фильтра, имитируя ситуацию , когда микроорганизмы находятся на CSF стороне и войти в контакт с апикальной стороне клеток (Фигура 1А, С). В противоположность этому, используя клетки HIBCPP в перевернутом культивирования клеток системы фильтра вставки отражает условия, когда бактерии попали в кровеносную. Микроорганизмы распространение в крови и столкновение CP эпителиальных клеток от базолатеральной стороны (рис 1B, D). Стоит отметить, что в этой модельной системе , было показано , что бактерии вторгаются клетки HIBCPP в полярном моды конкретно от базолатеральной стороны ячейки 5,7.
Впоследствии к заражению СР, инфильтрации патогены могут быть признаны врожденной иммунной системы посредством перевязки с рецепторами распознавания образов (РРСС). Хорошо описанные члены PRRs принадлежат к семейству Toll-подобный рецептор (TLR). может TLRs бинd к характерным структурам инфекционных микроорганизмов, которые называются патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMPs). Лигирование рецепторов приводит к активации клетки – хозяина сигнальных каскадов , которые вызывают экспрессию цитокинов и хемокинов 12, который в свою очередь стимулирует трансмиграции иммунных клеток поперек BCSFB 13,14. Было показано , что HIBCPP клетки экспрессируют несколько TLRs на уровне мРНК , так и , что заражение N. менингита приводит к секреции ряда цитокинов и хемокинов, включая CXCL1-3, IL6, IL8 и TNF & alpha ; 15,16.
Здесь мы описываем выращивание и заражение линии клеток человека HIBCPP в перевернутой системе вставки клеточной культуры, которая имитирует BCSFB. Эта модель система позволяет исследовать взаимодействия патогенов с в естественных условиях соответствующей стороны базолатеральной клеток, а также последующего клеточного ответа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эпителиальные клетки CP образуют BCSFB, отделяющую CSF от 2,3 крови. Недавно мы установили клеточную линию HIBCPP в качестве функциональной человеческой модели BCSFB. Клетки отображения важных барьерные функции BCSFB в пробирке, в том числе развития высокого мембранного потенциала, низко…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
Referências
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus – a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N’Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
