Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
Die Blut-Liquor – Schranke (BCSFB) ist einer der drei Sperrstellen zwischen Blut und Gehirn 1. Seine morphologische Korrelat sind die Epithelzellen des Plexus (CP) 2,3, eine endotheliale-epithelialen Konvolut, das in den Ventrikeln des Gehirns stark gefäß und befindet. Der CP dient der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), sowie zur Trennung der letzteren aus dem Blut zu erzeugen. Um die Barrierefunktion, die CP – Epithelzellen zeigen eine geringe pinozytotische Aktivität exprimieren spezifische Transporter und sind dicht verbunden durch ein kontinuierliches Netzwerk von Tight Junctions (TJs) 2,3 zu erreichen.
Menschliche Plexuspapillom (HIBCPP) Zellen, abgeleitet von einem bösartigen Plexuspapillom einer japanischen Frau 4, wurden verwendet , um einen funktionellen in vitro – Modell des BCSFB zu konstruieren. HIBCPP Zellen zeigen einige Eigenschaften eines funktions BCSFB wie die Bildung von TJStränge, die Entwicklung eines hohen transepithelialen Membranpotential, die als transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) und kleinere Permeabilitäten für Makromoleküle bestimmt werden kann. Darüber hinaus exprimieren HIBCPP Zellen charakteristische Transporter, die die ionische Mikro regulieren dienen können, und apikal / basolateralen Polarität 5,6,7 zeigen.
Die BCSFB wurde für Krankheitserreger (Bakterien, Viren und Pilze) in das zentrale Nervensystem (ZNS) 8 als Eintrittsstelle dargestellt funktionieren. Die Invasion von Krankheitserregern, einschließlich Neisseria meningitidis (N. meningitidis), ein gramnegative Bakterium, können schwere Krankheiten wie Meningitis verursachen. Der Nachweis , dass sie die Schutz epitheliale Barriere des CP überwindet , ist von histopathologischen Beobachtungen bei Patienten unterstützt mit Meningokokken – Erkrankung in den Gefäßen erhöhte Mengen an Meningokokken aufweisen und CP Epithelzellen 9,10. Um sich den Eintritt in die Wirtszellen bacteria fallen oft endozytotischen Mechanismen, die vermittelt werden, oder ausgelöst durch spezifische Oberflächenrezeptoren auf den Wirtszellen. Da Interaktionen von Pathogenen mit diesen Rezeptoren Spezies sein können spezifische 11, Tiermodelle können nur in beschränktem Umfang zu Rate gezogen werden. Die HIBCPP Zelllinie bietet die Möglichkeit, den Invasionsprozess sowie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen im menschlichen Modellsystem zu studieren. Zellkultur-Einsätze Einsatz ermöglicht es uns, aus zwei verschiedenen Zellseiten Interaktionen von Pathogenen mit Wirtszellen zu analysieren. Viele Bakterien, einschließlich N. meningitidis, sind die Auswirkungen der Schwerkraft während der Infektion Assays stark unterworfen. Für eine optimale Wechselwirkung der Pathogene mit den HIBCPP Zellen während des Assays werden die Bakterien zunächst in das obere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz System hinzugefügt. Zur Infektion von der apikalen oder der basolateralen Zellenseite ermöglichen jeweils zwei Varianten der in vitro – System gewesen ESTAblished: Im Standardsystem HIBCPP Zellen der oberen Kammer des Filtereinsatzes ausgesät, imitiert die Situation , wenn Mikroorganismen auf der CSF-Seite angeordnet sind und in Kontakt mit der apikalen Seite der Zellen (1A, C) erhalten. Im Gegensatz dazu spiegelt unter Verwendung der HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkulturfiltereinsatz System die Bedingungen, wenn Bakterien in den Blutstrom eingegeben haben. Mikroorganismen Verbreitung im Blut und Begegnung CP Epithelzellen aus der basolateralen Seite (1B, D). Bemerkenswert ist es in diesem Modellsystem wurde gezeigt , daß Bakterien eindringen HIBCPP Zellen in einem polaren Mode gezielt von der basolateralen Zellenseite 5,7.
Anschließend auf eine Infektion des CP können die Invasion von Krankheitserregern des angeborenen Immunsystems durch Ligation an Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) erkannt werden. Nun beschriebenen Mitglieder der PRRs gehören zu den Toll-like Rezeptor (TLR) -Familie. TLRs kann bind charakteristische Strukturen von infektiösen Mikroorganismen, die genannte pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) sind. Ligierung der Rezeptoren führt zur Aktivierung von Wirtszellsignalkaskaden , die Expression auslösen von Zytokinen und Chemokinen 12, die wiederum Transmigration von Immunzellen über den BCSFB 13,14 stimulieren. Es hat sich gezeigt , dass HIBCPP Zellen mehrere TLR auf mRNA – Ebene und , dass eine Infektion mit N. ausdrücken meningitidis resultiert in der Sekretion von mehreren Cytokinen und Chemokinen, einschließlich CXCL1-3, IL6, IL8 und TNFa 15,16.
Hier beschreiben wir Kultivierung und Infektion der menschlichen Zelllinie HIBCPP in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System, das die BCSFB nachahmt. Dieses Modellsystem ermöglicht Interaktionen von Pathogenen mit der in vivo relevant basolateralen Zellenseite sowie die nachfolgende zelluläre Antwort zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Epithelzellen des CP bilden die BCSFB, die die CSF aus dem Blut 2,3 trennt. Wir stellten kürzlich die HIBCPP Zelllinie als funktionelles menschliches Modell des BCSFB. Die Zellen zeigen wichtige Barrierefunktionen der BCSFB in vitro, einschließlich der Entwicklung eines hohen Membranpotential, eine geringe Permeabilität für Makromoleküle sowie die Anwesenheit von kontinuierlichen Strängen von TJs 5. Die TJ-Proteine tragen zu einem apikalen / basolateralen Polarität der Zel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
Referências
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