Um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da Barreira Fluid Human Blood-cefalorraquidiano para o Estudo de infecção bacteriana do lado basolateral

Resumo

As células epiteliais do plexo coróide (PC) formam a barreira do líquido cefalorraquidiano (BCSFB). Um modelo in vitro do BCSFB emprega células do papiloma do plexo coróide humano (HIBCPP). Este artigo descreve a cultura e a infecção basolateral de células HIBCPP usando um sistema de inserção de filtro de cultura de células.

Resumo

As células epiteliais do plexo coróide (PC), localizadas no sistema ventricular do cérebro, formam a barreira do líquido hemato-cefalorraquidiano (BCSFB). O BCSFB funciona na separação do líquido cefalorraquidiano (LCR) do sangue e na restrição da troca molecular ao mínimo. Um modelo in vitro do BCSFB é baseado em células derivadas de um papiloma do plexo coróide humano (HIBCPP). As células HIBCPP exibem funções de barreira típicas, incluindo a formação de junções apertadas (TJs), o desenvolvimento de uma resistência elétrica transepitelial (TEER), bem como pequenas permeabilidades para macromoléculas. Existem vários patógenos que podem entrar no sistema nervoso central (SNC) através do BCSFB e, posteriormente, causar doenças graves como a meningite. Um desses patógenos é Neisseria meningitidis (N. meningitidis), uma bactéria específica do ser humano. O emprego das células HIBCPP em um sistema de inserção de filtro de cultura de células invertidas permite estudar as interações de patógenos com células do BCSFB do lado da célula basolateral, o que é relevante in vivo. Neste artigo, descrevemos a semeadura e cultura de células HIBCPP em inserções de cultura de células. Além disso, é demonstrada a infecção das células com N. meningitidis, juntamente com a análise de bactérias invadidas e aderidas por imunofluorescência dupla. Como as células da PC também estão envolvidas em outras doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos como a doença de Alzheimer e a esclerose múltipla, bem como durante a metástase cerebral de células tumorais, o sistema modelo também pode ser aplicado em outros campos de pesquisa. Ele fornece o potencial para decifrar mecanismos moleculares e identificar novos alvos terapêuticos.

Introdução

A barreira de fluido cerebrospinal de sangue (BCSFB) é um dos três locais de barreira entre o sangue e o cérebro ^um. Seu correlato morfológicas são as células epiteliais do plexo coróide (CP) ^{de 2,3,} um convoluta-endotelial epitelial, que é fortemente vascularizado e localizado nos ventrículos do cérebro. A CP serve para produzir o fluido cerebrospinal (CSF), bem como para separar o último do sangue. A fim de conseguir a função de barreira, as células epiteliais CP mostram uma actividade pinocitótica baixo, expressar transportadores específicos, e estão densamente ligadas por uma rede contínua de junções apertadas (TJS) ^2,3.

Protocolo

1. Prepare Cultura celular filtro Incorporações nas células Sementeira HIBCPP em um sistema invertido Modelo

1. Pré-aquecido DMEM / F12 (HAM) suplementado com 5 ug / ml de insulina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de vitelo (FCS).
2. Use fórceps estéreis para colocar 0,33 cm² inserções de filtro de cultura de células da área de crescimento com um tamanho de poro de 3 um de cabeça para baixo em uma placa de 12 poços (Figura 1E).
3. Encha meio para dentro do compartimento inferior do cartucho do filtro de cultura de células (cerca de 3 ml) e 100 ul de topo do elemento do filtro. Inundar ....

Resultados

Aqui, descrevemos a cultura e infecção das células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertida. Este modelo nos permite estudar os mecanismos de invasão e as vias de sinalização molecular subjacente a partir do lado da célula basolateral, reproduzindo uma situação fisiológica de bactérias divulgação e entrar nas células epiteliais através da corrente sanguínea (Figura 1).

As células HIBCPP ex.......

Discussão

As células epiteliais do CP formar o BCSFB que separa o CSF a partir do sangue ^2,3. Recentemente, estabeleceu a linha de células HIBCPP como um modelo humano funcional do BCSFB. As células apresentam funções de barreira importantes da BCSFB in vitro, incluindo o desenvolvimento de um potencial de membrana elevada, uma baixa permeabilidade de macromoléculas, bem como a presença de filamentos contínuos de TJs ^5. As proteínas TJ contribuir para uma polaridade apical / basolateral das células........

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200-056
4&agudo;,6 diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Life Technologies	D1306
placas de 12 poços	Starlab	CC7682-7512
placas de 24 poços	Starlab	CC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMP			Este anticorpo foi um presente dos Drs. H. Claus e U. Vogel (Universidade de Wü rzburg, Alemanha)
Alexa Fluor 488 (frango anti-coelho)	Invitrogen	A21441
Alexa Fluor 594 (frango anti-coelho)	Invitrogen	A21442
Alexa Fluor 660 Faloidina	Invitrogen	A22285
Albumina de soro bovino (BSA)	Calbiochem	12659
Placas de ágar chocolate	Biomerieux	43109
Citocalasina D	Sigma	C8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES	Gibco	31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES sem Phenolred	Gibco	11039-047
Dimetilsulfóxido	Sigma	D2650
Soro fetal de bezerro (FCS)	Life Technologies	10270106
FITC-Inulina	Sigma	F3272
Insulina	Sigma	19278
MgCl2	Sigma	2393
NaHCO3	Sigma	55761
PBS + Mg + Ca	Gibco	14040-174
Penicilina/Estreptomicina	MP Biomedicals	1670049
Polyvitex	Biomerieux	55651
Proteose peptona	BD	211684
Meio sem soro	Gibco	10902-096
Inserções de cultura de células mais finas para placas de 24 poços, tamanho de poro 3 µ m	Greiner	662630
Balão de cultura de tecidos 75 cm² tampa vermelha estéril	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma	T8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 com MERSSTX01 eletrodo	Millipore	MERSSTX00