Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
La barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB) es uno de los tres sitios de barrera entre la sangre y el cerebro 1. Su correlato morfológico son las células epiteliales del plexo coroideo (CP) 2,3, un convoluta endotelial-epitelial, que es fuertemente vascularizada y situado en los ventrículos del cerebro. El CP sirve para producir el líquido cefalorraquídeo (CSF), así como para separar esta última de la sangre. Con el fin de lograr la función de barrera, las células epiteliales CP muestran una actividad pinocíticas baja, expresan transportadores específicos, y están densamente conectadas por una red continua de las uniones estrechas (TJs) 2,3.
Las células humanas del papiloma del plexo coroideo (HIBCPP), derivado de un papiloma del plexo coroideo maligna de una mujer japonesa 4, se utilizaron para construir un modelo funcional en vitro de la BCSFB. HIBCPP células muestran un par de características de un BCSFB funcional como la formación de TJhebras, el desarrollo de un potencial de membrana de alta transepitelial que puede ser determinado como la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), y permeabilidades menores de macromoléculas. Por otra parte, las células expresan transportadores HIBCPP característicos, que pueden servir para regular el microambiente iónica, y mostrar apical / basolateral 5,6,7 polaridad.
El BCSFB se ha demostrado que funcionan como un sitio de entrada para los patógenos (bacterias, virus y hongos) en el sistema nervioso central (CNS) 8. La invasión de patógenos, incluyendo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), una bacteria Gram-negativas, puede causar enfermedades graves como la meningitis. La evidencia de que supera la barrera del epitelio de protección de la CP es apoyado por observaciones histopatológicas en pacientes con enfermedad meningocócica que exhibe una mayor cantidad de meningococos en los vasos y células epiteliales CP 9,10. Para poder entrar en las células huésped bacteria menudo secuestrar mecanismos endocytotic, que están mediadas o provocados por los receptores de superficie específicos localizados en las células huésped. Dado que las interacciones de patógenos con estos receptores pueden ser especies modelos 11, específicas de animales sólo pueden ser consultados en un grado limitado. La línea celular HIBCPP ofrece la oportunidad de estudiar el proceso de invasión, así como los mecanismos moleculares subyacentes en un sistema modelo humano. El empleo de insertos de cultivo celular nos permite analizar las interacciones de los agentes patógenos con células huésped desde dos lados distintos. Muchas bacterias, incluyendo N. meningitidis, están firmemente sujeto a los efectos de la gravedad durante ensayos de la infección. Para la interacción óptima de patógenos con las células HIBCPP durante los ensayos, las bacterias se añaden inicialmente en el compartimento superior del sistema de inserción de filtro de cultivo celular. Para permitir la infección de la apical o el lado basolateral de células, respectivamente, dos variaciones del sistema de vitro han sido thiscidos: En el sistema estándar células HIBCPP se siembran en el compartimiento superior del inserto de filtro, imitando la situación cuando los microorganismos se encuentran en el lado del CSF y se meten en contacto con el lado apical de las células (Figura 1A, C). Por el contrario, el uso de las células HIBCPP en un sistema de filtro de inserto de cultivo celular invertida refleja las condiciones cuando las bacterias han entrado en la corriente sanguínea. Los microorganismos difunden en la sangre y las células epiteliales CP encuentro desde el lado basolateral (Figura 1 B, C). Digno de mención, en este sistema modelo se ha demostrado que las bacterias invaden las células HIBCPP de una manera polar específicamente del 5,7 lado celular basolateral.
Posteriormente a la infección de la CP, los patógenos invadido pueden ser reconocidos por el sistema inmune innato a través de la ligadura a receptores de reconocimiento de patrones (PRR). los miembros descritos bien de los derechos y responsabilidades parentales pertenecen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR). TLRs puede cubod para estructuras características de los microorganismos infecciosos, que son patrones moleculares asociados a patógenos (denominado PAMPS). La ligación de los receptores conduce a la activación de la célula huésped cascadas de señalización que activan la expresión de citocinas y quimiocinas 12, que a su vez estimulan la transmigración de las células inmunes a través de la BCSFB 13,14. Se ha demostrado que las células HIBCPP expresan varios TLRs a nivel de mRNA y que la infección con N. meningitidis resulta en la secreción de varias citocinas y quimiocinas, incluyendo CXCL1-3, IL6, IL8 y TNF 15,16.
A continuación, describimos el cultivo y la infección de la línea celular humana HIBCPP en un sistema de inserción de cultivo celular invertida que imita la BCSFB. Este sistema modelo permite estudiar las interacciones de patógenos con el lado in vivo relevante celular basolateral, así como la respuesta celular posterior.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células epiteliales de la CP forman la BCSFB que separa el CSF desde el 2,3 sangre. Recientemente se estableció la línea celular HIBCPP como un modelo humano funcional de la BCSFB. Las células muestran importantes funciones de barrera de la BCSFB in vitro, incluyendo el desarrollo de un alto potencial de membrana, una baja permeabilidad para las macromoléculas, así como la presencia de hebras continuas de TJs 5. Las proteínas TJ contribuyen a una polaridad apical / basolateral d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
Referências
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