Un plexus choroïde épithéliale Modèle base de cellules de la barrière Fluid Human Blood-céphalo-rachidien pour étudier l'infection bactérienne du côté basolatéral
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
La barrière hémato-céphalorachidien (BCSFB) est l' un des trois sites de barrière entre le sang et le cerveau 1. Corrélat morphologique sont les cellules epitheliales du plexus choroïde (CP) 2,3, une spire endothéliale épithéliale, qui est fortement vascularisée et situé dans les ventricules du cerveau. Le CP sert à produire le liquide céphalorachidien (LCR), ainsi que pour séparer celui-ci du sang. Afin d'obtenir la fonction de barrière, les cellules épithéliales CP présentent une activité faible pinocytose, expriment des transporteurs spécifiques, et sont fortement connectés par un réseau continu de jonctions serrées (TJS) 2,3.
Human papilloma du plexus choroïde (HIBCPP) cellules, dérivées d'une maligne plexus choroïde papillome d'une femme japonaise 4, ont été utilisés pour construire une fonctionnelle dans le modèle in vitro de l'BCSFB. HIBCPP cellules présentent quelques caractéristiques d'une BCSFB fonctionnelle que la formation de TJbrins, le développement d'un potentiel de membrane transépithélial élevée qui peut être déterminé que la résistance électrique transépithélial (TEER), et des perméabilités mineures pour macromolécules. En outre, les cellules HIBCPP expriment les transporteurs caractéristiques, qui peuvent servir à réguler le microenvironnement ionique, et de montrer apical / basolateral 5,6,7 de polarité.
Le BCSFB a été montré pour fonctionner comme un site d'entrée pour les agents pathogènes (bactéries, virus et champignons) dans le système nerveux central (SNC) 8. L'invasion de pathogènes, y compris Neisseria meningitidis (meningitidis N.), une bactérie à Gram négatif, peut provoquer des maladies graves comme la méningite. Preuve qu'il surmonte la barrière épithéliale protectrice du CP est pris en charge par des observations histopathologiques chez les patients avec une maladie méningococcique présentant des quantités accrues de méningocoques dans les vaisseaux et les cellules CP épithéliales 9,10. Pour gagner l'entrée dans des cellules hôtes bacteria détournent souvent des mécanismes d'endocytose, qui sont médiées par des récepteurs ou déclenchées de surface spécifiques situés sur les cellules hôtes. Depuis les interactions des agents pathogènes avec ces récepteurs peuvent être des espèces modèles spécifiques 11, animaux ne peuvent être consultés dans une mesure restreinte. La lignée cellulaire HIBCPP offre la possibilité d'étudier le processus d'invasion, ainsi que les mécanismes moléculaires sous-jacents dans un système de modèle humain. En utilisant des inserts de culture cellulaire permet d'analyser les interactions des agents pathogènes avec les cellules hôtes à partir de deux côtés de cellule distincts. Beaucoup de bactéries, y compris N. meningitidis, sont fortement soumis à l'impact de la gravité au cours des essais d'infection. Pour une interaction optimale des agents pathogènes avec les cellules HIBCPP au cours des essais, les bactéries sont tout d'abord ajoutés dans le compartiment supérieur du système d'insertion de filtre de culture cellulaire. Pour permettre l' infection de la apical ou du côté de la cellule basolatérale, respectivement, deux variantes du système de vitro ont été established: Dans le système standard de cellules HIBCPP sont ensemencés dans le compartiment supérieur de l'insert filtrant, mimant la situation dans laquelle les micro – organismes sont situés sur le CSF-côté et entrer en contact avec le côté apical des cellules (Figure 1A, C). En revanche, en utilisant les cellules HIBCPP dans un système d'insertion de filtre de culture cellulaire inversée reflète les conditions lorsque les bactéries ont pénétré dans le flux sanguin. Microorganismes diffusent dans le sang et la rencontre CP cellules épithéliales du côté basolatéral (Figure 1B, D). Il convient de noter qu'il a été démontré que , dans ce système de modèle que les bactéries envahissent les cellules d'une manière HIBCPP polaire spécifiquement du côté basolatéral de 5,7 cellulaire.
Par la suite à l'infection du CP, les agents pathogènes envahis peuvent être reconnus par le système immunitaire innée par ligature à des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). membres bien décrits des PRR appartiennent à la famille des récepteurs Toll-like (TLR). TLR peut bind à des structures caractéristiques des micro-organismes infectieux, qui sont des modèles de Appelés associés à des pathogènes moléculaires (PAMP). Ligation des récepteurs conduit à l' activation de la cellule hôte en cascade de signalisation qui déclenchent l' expression de cytokines et de chimiokines 12, qui à leur tour stimulent la transmigration des cellules du système immunitaire à travers la BCSFB 13,14. Il a été démontré que les cellules expriment HIBCPP plusieurs TLR au niveau de l' ARNm et que l' infection par N. meningitidis entraîne la sécrétion de plusieurs cytokines et de chimiokines, y compris CXCL1-3, IL6, IL8 et TNFa 15,16.
Ici, nous décrivons la culture et l'infection de la lignée cellulaire humaine HIBCPP dans un système d'insert de culture cellulaire inversée qui imite la BCSFB. Ce système modèle permet d'étudier les interactions des agents pathogènes avec la partie pertinente in vivo basolatérale des cellules ainsi que la réponse cellulaire ultérieure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules épithéliales du CP forment le BCSFB qui sépare le LCR de 2,3 sanguin. Nous avons récemment établi la lignée cellulaire HIBCPP comme un modèle humain fonctionnel du BCSFB. Les cellules présentent des fonctions de barrière importantes du BCSFB in vitro, y compris le développement d'un potentiel de membrane élevé, une faible perméabilité pour les macromolécules, ainsi que la présence de fils continus de TJs 5. Les protéines TJ contribuent à une polarité api…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
Referências
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