İnsan Kan BOS Bariyer A Koroid Pleksus Epitel Hücre bazlı Modeli bazolateral Side Bakteriyel Enfeksiyon Eğitim için
Summary
The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
Abstract
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
Introduction
Kan-beyin-omurilik sıvısı bariyeri (BCSFB) kan ve beyin 1 arasında üç engelleyici yerlerden biridir. Morfolojik korelasyon koroid pleksus (SP) 2,3 epitel hücreleri, güçlü bir vaskülarize ve beyin ventriküller bulunan bir endotelyal ve epitelyal bükülü. CP serebrospinal akışkan (CSF) üretimi için hem de kan ikinci ayırma görevini görür. Bariyer fonksiyonunu elde etmek için, CP epitel hücreleri, düşük pinositoz aktivite gösteren spesifik taşıyıcıları ifade eder ve yoğun sıkış kesişmeler (TJs) -2,3 sürekli bir ağ ile birleştirilir.
Japon kadın 4 kötü huylu bir koroid pleksus papillomu türetilen insan koroid pleksus papillomu (HIBCPP) hücreleri, BCSFB in vitro model fonksiyonel oluşturmak için kullanıldı. HIBCPP hücreleri TJ oluşumu gibi bir fonksiyonel BCSFB özellikleri bir çift göstermektedirşeritler, transepitelyal elektrik direnci (TEER) gibi belirlenebilir yüksek transepitelyal membran potansiyeli geliştirilmesi ve Makromoleküller için az geçirgenlik. Ayrıca, HIBCPP hücreleri iyonik mikro düzenleyen hizmet ve bazolateral / apikal polarite 5,6,7 gösterebilir karakteristik taşıyıcıları, ifade eder.
BCSFB merkezi sinir sistemi (MSS) 8 içine patojen (bakteriler, virüsler ve mantarlar) için bir giriş yeri olarak işlev gösterilmiştir. Neisseria meningitidis (N. meningitidis), Gram-negatif bakteri de dahil olmak üzere patojenlerin, işgali menenjit gibi ciddi hastalıklara neden olabilir. Bu CP koruyucu epitel engelinin üstesinden gelecek, kanıtlar meningokok hastalığı damar ve CP epitel hücreleri 9,10 meningokoklara artan miktarlarda sergileyen hastalarda histopatolojik gözlemler ile desteklenir. konakçı hücreler ba içine girmeyecteria genellikle aracılık ettiği veya konakçı hücreler üzerinde bulunan spesifik yüzey reseptörleri tarafından tetiklenen endositoksik mekanizmaları kaçırma. Bu reseptörler ile patojenlerin etkileşimleri türler olabilir çünkü belirli 11, hayvan modelleri sadece kısıtlı ölçüde konsülte edilebilir. HIBCPP hücre hattı işgali sürecinin yanı sıra bir insan modeli sisteminde altta yatan moleküler mekanizmaları incelemek için fırsat sağlar. Hücre kültürü ekler istihdam iki ayrı hücre taraftan konakçı hücreleri ile patojenlerin etkileşimleri analiz etmemizi sağlar. Bir çok bakteri, aşağıdakileri içeren N. meningitidis enfeksiyonu deneyleri sırasında yerçekimi etkisi güçlü bir şekilde bağlıdır. deneyleri sırasında HIBCPP hücreleri ile patojenlerin optimum etkileşim, bakteriler, başlangıçta hücre kültürü filtre elemanı sisteminin üst bölmeye eklenir. Sırasıyla, in vitro sistemde iki varyasyonları olmuştur esta apikal veya bazolateral hücre tarafından enfeksiyonu etkinleştirmek içinblished: Standart sistemde HIBCPP hücreleri mikroorganizmalar CSF-tarafında yer alan ve hücreler (Şekil 1A, C), apikal kısmı ile temas içine almak da durum taklit filtre elemanının üst bölmesine ekilir. Buna karşılık, bir ters hücre kültürü filtresi elemanı sisteminde HIBCPP hücreleri kullanılarak bakteri kan dolaşımına girmiş koşullarını yansıtmaktadır. Mikroorganizmalar bazolateral tarafı (Şekil 1B, D) kan ve karşılaşma CP epitel hücrelerinde yaymak. Dikkate değer olarak, bu model sistemde bakteri bazolateral hücre tarafı 5,7 arasında, özellikle polar bir şekilde HIBCPP hücreleri istila gösterilmiştir.
Daha sonra CP enfeksiyon, işgal patojenler örüntü tanıma reseptörleri ligasyon yoluyla doğuştan gelen bağışıklık sistemi (PRR) tarafından kabul edilebilir. PRR ve iyi tanımlanmış üye Toll-benzeri reseptör (TLR) ailesine aittir. TLR can binVadeli patojenle ilişkili moleküler yapılar (PAMPS) olan bulaşıcı mikroorganizmaları genel karakteristik özellikleri, d. Reseptör bağlama da BCSFB 13,14 boyunca bağışıklık hücrelerinin göçünde uyaran sitokinler ve kemokinlerin 12 ekspresyonunu tetikleyen konakçı hücre aktivasyonu sinyal iletim yol açar. Hücreler, birkaç HIBCPP mRNA düzeyindeki TLR ve N ile birlikte bu enfeksiyon ifade gösterilmiştir meningitidis CXCL1-3, IL6, IL8 ve TNFa 15,16 dahil olmak üzere çeşitli sitokinler ve kemokinlerin, salgılanması ile sonuçlanır.
Burada, BCSFB taklit eden bir ters hücre kültürü uç sisteminde yetiştirme ve insan hücre hattı HIBCPP enfeksiyonunu tarif eder. Bu model sistemi, in vivo ilgili bazolateral hücre tarafı hem de daha sonra, hücresel yanıt patojenlerin etkileşimleri incelemek için olanak sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
SP'nin epitel hücreleri, kan 2,3 dan CSF ayıran BCSFB oluştururlar. Son zamanlarda BCSFB bir fonksiyonel insan model olarak HIBCPP hücre hattı kuruldu. Hücreler, yüksek membran potansiyelinin geliştirilmesi, makromoleküller için düşük geçirgenlik, aynı zamanda TJs 5 sürekli elyaf varlığı da dahil vitro BCSFB arasında önemli bir engel fonksiyonlarını gösterir. TJ proteinler hücrelerin bazolateral / apikal kutuplarına katkıda bulunur. kutup yüzeyi reseptörler…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
Referências
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).
- Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP). Hum Cell. 18, 67-72 (2005).
- Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PloS One. 7, e30069 (2012).
- Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. , (2014).
- Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. The choroid plexus – a multi-role player during infectious diseases of the CNS. Front Cell Neurosci. 9, 80 (2015).
- Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC. J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).
- Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays. Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).
- Beutler, B. Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases. Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).
- Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. Trafficking of immune cells in the central nervous system. J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).
- Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. Cell trafficking through the choroid plexus. Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).
- Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163 (2014).
- Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro. J Neuroinflammation. 10, 30 (2013).
- McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease. Lancet. 337, 514-517 (1991).
- Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity. J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).
- Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport. Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).
- Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).
- Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).
- Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).
- Laflamme, S., Rivest, S. Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components. FASEB J. 15, 155-163 (2001).
- Zughaier, S. M. Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2. J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).
- Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature. 430, 218-222 (2004).
- Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N’Guessan, P. D., et al. Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium. Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).
- Jaerve, A., Muller, H. W. Chemokines in CNS injury and repair. Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).
- Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Virus Res. 170, 66-74 (2012).
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Dickson, P. W., Schreiber, G. High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus. Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).
- Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).
- Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).
- Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines. Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).
