Summary
בדו ח זה, היתרונות של תרבויות organotypic ותרבויות הפומבית העיקרי של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים מודגשים לחקור מגוון רחב של מנגנונים הקשורים אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, בתגובה זיהום ויראלי.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר מודל ex-vivo של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים (DRG) explant במבחנה DRG-derived משותף ותרבות של חלופה מועדפת החישה הניריונים ותאי גלייה בלוויין. אלו דגמים שימושי ופסיביות לחקור מגוון רחב של תגובות ביולוגיות המשויך בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים של מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) החל אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, זיהום ויראלי. השימוש DRG explant הוא מדעית יתרון בהשוואה למודלים פשטנית תאים בודדים מסיבות רבות. למשל, כמו תרבות organotypic, explant DRG מאפשר העברה ex-vivo של הרשת העצבית כולה כולל את microenvironment חוץ-תאית לשחק תפקיד משמעותי כל הפונקציות עצביים, גליה. עוד יותר, DRG explants יכול גם להישמר שמחוץ במשך מספר ימים ועל תנאי התרבות יכול להיות מוטרד ככל הרצוי. בנוסף, הרפובליקה שנקטפו יכול להיות עוד יותר הפומבית לתוך במבחנה שיתוף תרבות של נוירונים סנסוריים העיקרי ותאי גלייה בלוויין לחקור אינטראקציה עצביים-גליה, neuritogenesis, חרוט עצב אינטראקציה עם חוץ-תאית microenvironment, כללי יותר, כל היבט המשויך חילוף החומרים עצביים. לכן, המערכת DRG-explant מציע מידה רבה של גמישות ללימוד מגוון רחב של אירועים הקשורים לתנאי ביולוגי, פיזיולוגיים ופתולוגיים באופן יעיל.
Introduction
כתב יד זה, אנחנו מדווחים שיטה לקבל מודל לשעבר ויוו organotypic של מערכת מודל DRG העכבר נגזר כמו microenvironment כמו רקמות שהשתמרו לחקור מגוון רחב של תגובות ביולוגיות עלבונות מערכת העצבים ההיקפית החל נוירון-גליה אינטראקציה, והנוירולוגיה הפלסטית, סמנים דלקתיים, לזיהום ויראלי... בנוסף, בהמשך פיתחנו פרוטוקול כדי ליצור תרבות משותפת העיקרי של נגזר DRG נוירונים סנסוריים יחיד ותאים בלוויין.
הרפובליקה הם בלוויין אפור-חומר-יחידות ממוקם מחוץ למערכת העצבים המרכזית (CNS) לאורך עמוד השדרה הגבי שורשי עצבים בעמוד השדרה. הרפובליקה, הממוקם בסמיכות foramina בין-חולייתי, בית pseudounipolar החישה הניריונים, לוויין גלייה. הנוירונים pseudounipolar כוללים neurite יחיד זה מתפצל תהליך היקפיים נושאת תשומות סומאטית ואת הקרביים של מטרות היקפיים לגוף התא, תהליך מרכזי שישלח מידע חושי מהגוף תא לתוך מערכת העצבים. הלקט חיבור מגדיר ומבודד מקבץ היקפיים של נוירונים ותאי גלייה של מערכת העצבים. אין העברה תא כמחנכת או ממנו הרפובליקה פעם שתיארנו, גומחת תאי גזע מקומי אחראי neurogenic אירועים המתרחשים לאורך כל החיים1. לכן, מודל זה מתאים במיוחד ללמוד נוירוג'נסיס למבוגרים, axonogenesis, תגובה טראומטית הנגע ו תא מוות2,3,4,5,6,7 8, ,9 .
בתחום neuroregeneration, הרפובליקה שנקטפו ויוו , explanted במבחנה מתרבה axonotmesis, מצב הפציעה אקסונים אשר מלא במחוז, הגוף תאים עצביים מנותקת מן המטרה innervated10 ,11. זה ידוע כי פגיעה במערכת העצבים ההיקפית יכול לגרום ירידה ו מוגברת גנים של הרפובליקה, רבים של שינויים אלה הם תוצאה של תהליכי הרגנרציה אך רבים יכול להיות גם תוצאה של התגובה החיסונית או תגובה נוספת מתאי שאינם עצבית. על-ידי שימוש של ex-vivo מערכת מבודדת DRG, חלק המורכבות הזו יוסר ולא מסלולים מכניסטית יכולה להיחקר בקלות רבה יותר.
מלבד תפקידה המרכזי להולכת תשומות חושי אל מערכת העצבים, השפע של קולטני נוירוטרנסמיטרים רבים כולל גאבא12,13,14,15 ברמה של סומא עצביים וכן עדות interneuronal קרוס-עירור יכול להציע כי DRG הם מתוחכמים אינטגרטורים ראשוני של תשומות חושים16,17. אלו הממצאים החדשים להתייעץ כדי explant DRG המאפיינים של מערכת רשת עצבית מיני הדומה דגמים אחרים "מיני המוח", אשר organoids עצבני-רקמות ספציפיות בשימוש עבור שדות ניסיוני רחבה יותר של החקירה וטיפוליים הגישה מחלות נוירולוגיות18,19. הראיות הללו יחד עם העובדה כי הרפובליקה היא אשכול נפרד ומוגדר היטב של הרקמה העצבית מוקף קפסולה חיבור, לעשות את זה איבר מתאים עבור השתלת ex-vivo .
העכבר culturing DRG מציג אפשרות multicellular מושכת לדגם pathophysiologies האדם בשל דמיון גנטי מבניים בין המינים. בנוסף, מאגר גדול של זנים העכבר הטרנסגניים היא תורמת מאוד מכניסטית מחקרים עתידיים. סיומת Neurite במהלך הפיתוח והן לאחר פציעה דורש מכני האינטראקציות בין צמיחה חרוט, המצע20,21. ננו, מיקרו-בדוגמת סובסטרטים שימשו ככלים neurite תוצר ישיר של להפגין את היכולת שלהם מגיבים לתכונות הטופוגרפי ב- microenvironments שלהם. נוירונים הוכחו לשרוד, דבקים, להעביר, אוריינט אקסונים שלהם כדי לנווט תכונות פני השטח כגון חריצים סובסטרטים22,23. עם זאת, מחקרים אלה נעזרו בדרך כלל שורות תאים בתרבית וזה קשה לחזות איך ראשי עצביים תאים הרצון להשיב רמזים מוגדרים היטב, פיזית ויוו או ex-vivo.
הדגם explant ex-vivo של העכבר DRG המשמש עבור הצעה זו מחקה את התא אמיתי-תא אינטראקציה, סימנים ביוכימיים סביב האקסונים הגדלים. בקרב רבים שונים פרדיגמות ניסיוני ועד התחדשות עצב, ייצור neurosphere, neuroinflammation, הרפובליקה explant דגם ימשיך לשמש כלי רב ערך לחקור ההיבט זיהום וההשהיה ויראלי בתוך החישה הגרעינים24,25,26,27.
באופן כללי, מערכת העצבים (NS) הוא יעד עבור זיהומים נגיפיים28,29,30. רוב הווירוסים להדביק תאים אפיתל, אנדותל משטחים ולעשות דרכם מן הרקמה משטח NS דרך העצבים ההיקפית סיבי ורפלקסי. בפרט, נגיף הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) לאחר זיהום ראשוני בתאי אפיתל יוצר השהיה חיים ארוך בשנת הגרעינים חושית רצוי, הרפובליקה של31,מערכת העצבים ההיקפית32. HSV-1 neuroptropic יכולת להדביק את מערכת העצבים ההיקפית מוביל בסופו של דבר מחלות נוירולוגיות33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים לרבות השימוש החיות אושרו על ידי סקירה מוסדיים שאושרו על-ידי לוח הפרוטוקולים (אוניברסיטת נברסקה-IACUC).
1. קצירת DRG מעוברים עכבר
-
המתת חסד העכברים למבוגרים בשיטה חנק (CO2) ואחריו עריפת ראש. מיד להמשיך בניתוח להסיר את עמוד השדרה.
- לחשוף את עמוד השדרה על ידי כריתת לשכבת העור dorsally באמצעות מספריים משובחים. לבודד את עמוד השדרה על ידי גזירה את הצלעות משני צדדיו של העמודה ולפנים הצולב הפרדת בעמודה השדרה משאר החיות.
- הר של עמוד השדרה (הגחון בצד למעלה) על גבי שטיחון כירורגי באמצעות מחטים/סיכות.
- באמצעות מספריים בסדר הפוך כפול חותכים בשני הצדדים של הגופים בחוליות לחשוף את הצד הבטני של תעלת השדרה.
- תחת מיקרוסקופ כירורגי (הגדלה מוגדרת כ- 4 X), להשתמש במספריים בעדינות להזיז חוט השדרה בצד כדי לחשוף את השורשים בעמוד השדרה הגבי contralateral כדי לאתר את DRG, לאורך שורשי העצבים ההיקפיים העזוב. כל גנגליון חלקית חבוי את foramina בין-חולייתי.
- הקציר הרפובליקה, לצבוט את השורש העזוב (בין הרפובליקה חוט השדרה) עם מלקחיים אחד ומשוך בעדינות את הרפובליקה של נקב בין-חולייתי.
- במקום השני המלקחיים על העצב השדרה היקפיים כדי הרפובליקה ומשוך את DRG יחד עם עצבי השדרה בסיס עמוד השדרה.
- מקם את DRG שנאספו 35 מ מ פטרי המכילות 3 מ"ל של סרום כקרח מדיה פנויה (SFM)34.
- העברת כל DRG בודדים בכוס יבש פטרי, תחת מיקרוסקופ כירורגי, לנקות, לקצץ את עודף סיבים ואת רקמות החיבור עדיין מחובר הרפובליקה באמצעות להב. הרפובליקה הוא קל לזיהוי כמבנה שקוף וכשכתבתי לאורך השדרה עצב/השורש הלבן. כלי דם לעיתים קרובות נמצאים סביב הרפובליקה.
- מקום נקי הרפובליקה צלחת פטרי החדש מכיל מדיה מסוג SFM קר כקרח.
- לדלל את התערובת חלבון ז'לטין (ראה טבלה של חומרים) תוך קר כקרח SFM (1:1).
- צלחת DRG ex-vivo ב 12-ובכן צלחות מצופה מראש 10/20 µL תערובת חלבונים כמו ג'לי ולהגדיר אותם בתוך החממה-CO של 37 ° C ו- 5%-2 למשך 30-60 דקות.
- בעדינות להוסיף 1.5-2 מ"ל של SFM מערכת התרבות לכסות את explant שלמה ולתחזק את explants ב culturing תנאים (37 ° C ו- 5% CO2).
הערה: זהו צעד קריטי כי הרפובליקה היא מעוגנת את כלי הזכוכית רק על ידי תערובת חלבונים כמו ג'לי polymerized. הזמן של פלמור ומיומנויות pipetting הם קריטיים כדי למנוע הצפה. - לשנות את המדיום של גידול DRG כל 72 h ולתת את DRG לגדול לאורך זמן רב ככל הדרוש.
2. בידוד תא בודד נוירונים מ- DRG
- המקום כל הרפובליקה שנגבו בשפופרת סטרילי 1.5 mL עם 1.2 מ ל F12 המדיה המכילה 1.25 מ"ג/מ"ל של collagenase הרביעי, דגירה זה ב 37 ° C ו- 5% CO2 במשך 45 דקות חזור על שלב זה עבור עוד 45 דקות לאחר הדגירה הראשון.
- לטפל explants עם 2 מ ל F12 המדיה המכילה טריפסין (0.025%) במשך 30 דקות מיד לאחר הטיפול collagenase הרביעי של 37 ° C ו 5% CO2.
- דגירה עם 2 מ ל F12 המדיה המכילה סרום שור עוברית (FBS; 33%)-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 15 דקות.
- לשטוף explants שלוש פעמים עם 2 מ ל F12 מדיה והמשך מכנית מביצועם אותם עם פיפטה מזכוכית עד המדיה הופך מעוננים.
הערה: הליך זה כרוך אוסף של לנקות/גזוז DRG מן החיה כפי שהוסבר בסעיף הקודם. בעת ביצוע מכני דיסוציאציה של explants, תהיה עדין, אל תשתמש בכוח מופרז מאז זה יכול להוביל זליגת ואובדן של חומר עבודה. - לסנן את התרבות התא הפומבית דרך מסנן מיקרומטר 0.22 להסרת כל זיהומים, עודף רקמת חיבור. Centrifuge תא המסוננות lysate ב (2,500 x g) למשך 2 דקות.
- להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 500 µL של התקשורת neurobasal המכיל תוספת לתרבות עצביים (1 x), תערובת אנטיביוטיקה (1 x), L-גלוטמט (0.5 מ מ), ואת עצבי פקטורי גדילה (5 µg/mL) (ראה טבלה של חומרים).
- צלחת התאים dissociated על גבי מכסה מצופה laminin שקופיות (µg 50/mL; ראה טבלה של חומרים)-צפיפות תא המועדפת. לקבוע את צפיפות התאים באמצעות מונה תא.
הערה: אנחנו מצופה תאים על 25,000 תאים/כיסוי שקופיות. טכניקה זו מאפשרת דיסוציאציה של שני נוירונים ותאי גלייה בלוויין. הרכיב גליה תרבותי משותף עם הנוירונים pseudounipolar תפקיד קריטי להישרדות עצביים.
3. HSV-1 זיהום של DRG Explants ותאים DRG-derived חלופה מועדפת
הערה: עבודה זו נעשה על ידי בקפדנות בעקבות הדרישות (BSL-2) ברמה 2 אבטחה אשר יש לנו מעבדה מאובזר אושרה על ידי הוועדה אבטחה אוניברסיטת נברסקה. זן קוס של HSV-1 נעשה שימוש במחקר זה. נא לקחת את המידות המתאימות ואת אמצעי זהירות לפי הנחיות המוסדות המקומיים אם עובד עם זני וירוס.
- לקבוע והכן הנגיף דילולים הנכון בתקשורת SFM להדביק את המודל. הווירוס השתמשו במחקר זה היה זן קוס של HSV-1. בעת עבודה עם DRG-derived הפומבית תאים, השתמש 1 יחידה של ריבוי של זיהום (MOI) עבור זיהום, כלומר המספר של וירוס שווה מספר התאים.
- אם מדביקים DRG explants, להשתמש מספר virions (למשל, 10,000 virions) כי לא ניתן לקבוע את מספר מדויק של תאים explant.
- המקום התאים/explant כדי להיות נגוע בווירוס צלחת תא סטרילי או שפופרת המכילה תערובת של מדיה מסוג SFM וירוס.
הערה: השתמשנו 25,000 virions עבור שקופית כיסוי המכיל תאים 25,000 (1 MOI). כדי להדביק את explant, אנו משתמשים 10,000 virions. - למקם את התא צלחת או צינור ב 37 ° C זיהום להתקיים; זמן החשיפה ויראלי עשוי להשתנות בהתאם infectivity ויראלי.
הערה: ערך ויראלי אושר על-ידי שימוש אורתופדיה-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) ו- (X-גל) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside מבחני26.
4. immunofluorescence
- לתקן את explants ודוגמאות תא בודד בפורמלין 4% מוכן בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). רחץ דגימות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב- PBS.
- דגירה בדגימות עם הרצוי נוגדנים הראשי (anti-β-טובולין, anti-peripherin, נוגדן anti-הפאראן גופרתי (HS), ו/או אנטי-גליקופרוטאין D (gD); ראו טבלה של חומרים דילולים) מדולל במאגר PBS עם 0.3% טריטון-X (PBST) ל- 10 % עז נורמלית בסרום. חנות דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את הדגימות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד עם PBS. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 1 h בהנוגדן המשני המתאים (488 ו/או Cy3; ראה טבלה של חומרים עבור דילולים) מדולל ב- PBS.
- לשטוף את הדגימות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד עם PBS. דגירה בדגימות עם Hoechst צבען (1.5 מיקרומטר) ב- PBS כעשרים דקות לפני שלב הרכבה.
- הר הדגימות בשקופיות זכוכית באמצעות קרינה פלואורסצנטית הרכבה בינונית coverslip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ריבוי הפנים של אינטראקציה והנוירולוגיה הפלסטית ואקולוגיה נוירון יכול ייחקרו באמצעות DRG ודגם תרבות ותא חלופה מועדפת. התחלנו את המחקרים על-ידי בידוד של explant DRG ותאים DRG-derived הפומבית כמו סכמטי מיוצג באיור1. רקמות ומודלים תאים בודדים ניתן לנתח באמצעות מגוון רחב של טכניקות מולקולריות כגון immunofluorescence, תספיג, מבחני גנומית וטכניקות אנליטיות אחרות בהתאם לאופי עיצוב ניסיוני וכוונותיהם. ראשית, השתמשנו במודל explant שלנו DRG לחקור את ההשפעה של סימנים ביוכימיים על עצב צמיחה (איור 2). Immunofluorescence כפולים או משולשים, הביטוי דיפרנציאלית של peripherin (איור 2 א, ב'; אדום) וβ-טובולין (איור 2 א, ב'; ירוק) היו אישר הן בתוך הגופים תאים עצביים, נבטים neurite היקפיים. גרעין התא זוהו עם צביעת הכסט (איור 2 א; כחול). הביטוי של הסימנים הנ ל היה רחוק נותח ב- explant-DRG כולו לאחר קיבוע ב 4% paraformaldehyde ו מיקרוטום-חלוקתה (איור 3 א). התוצאות שלנו אישר כי peripherin וβ-טובולין באופן סלקטיבי, מבוטאים subpopulations שני של נוירונים ganglionic עם peripherin באות לידי ביטוי ב "קטן, אור" ו β-טובולין, subpopulations "גדול, כהה" של נוירונים, בהתאמה. Immunolabeled neurites עם או סמן הבוקע החישה הניריונים נמצאו זורם גנגליון כולו לפני היציאה אל הפריפריה. צביעת הכסט מזוהה בעיקר את המיקום של הגרעינים בלוויין גליה בתוך גנגליון. כמצוין ב- 3B איור, האינטראקציה תא נוירון-לוויין ניתן לאבחן טוב יותר לאחר הטכניקה דיסוציאציה התא מלא. תא בלוויין מוכתם כחול גרעינים נראו סביב סומא עצביים חושית β-טובולין-חיוביות neurites הנרחב שלה.
אנחנו עוד יותר מנוצל התאים DRG-derived הפומבית לחקור זיהום HSV-1 ולא קשורה לתגובה דלקתית בתוך הנוירונים חושית (איור 4). לאחר רק 1 h לזיהום פוסט (פרטי), HSV-1 כניסה זוהה באמצעות נוגדן gD אנטי-HSV-1 הן תאי גליה (איור 4A) והן DRG נוירונים (איור 4B). בנוסף, HS מכתים נוסף בוצע מאז HS מספק של אתרי עגינה עבור וירוס מצורף או איגוד לתא המארח. HS המכונה מרכיב קריטי של מטריצה חוץ-תאית תפקודי (ECM) ו מתועדים בהרחבה לשחק תפקיד מרכזי אדהזיה תא מתא לתא איתות, ECM שיפוץ במהלך ריפוי הפצע, התפתחות, סרטן הפלישה, פיברוזיס, ב35,neuroinflammation36. מעניין, הבחנו HS מכתים ב- ECM רומזת תפקידה פוטנציאליים microenvironment המאפשר לצמיחה עצב (איור 4C). לבסוף, עבור β-טובולין מכתים השתמשנו כסמן חיובי עבור neurites כדי לוודא את התקינות של הנוירונים.
איור 1 . ייצוג סכמטי של הרפובליקה ניסיוני, רווק תא תרבות מודלים. DRG הם בודדו אותנו מהמתרחש NIH למבוגרים/שוויצרי עכברים, ניקיתי. יתר רקמת חיבור דרכים, ואני גם explanted ex-vivo כמו explant כל או חלופה מועדפת ראשי תרבות שיתוף של נוירונים סנסוריים ותאים בלוויין. שני הדגמים יכול לשמש עבור ניתוחים נוספים עם מספר שיטות אנליטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . פיתוח של תרבות organotypic DRG מערכת מודל לחקור צמיחת עצב. DRG גדל במשך 6 ימים שמחוץ שימשו כדי לחקור עצב מגיחה explant. אנחנו מראים על-ידי immunofluorescence כמה שונה תנאים הביוכימי יכול להשפיע על חלוקת סיבים נבטים: גדל באופן אקראי, לא מאורגן (א) לעומת לינאריות ומאורגן יותר אופנה (B). Explants מסומנות עם אנטי-β-טובולין (ירוק), אנטי-peripherin (אדום). גרעין התא מוכתמים Hoechst כתם (כחול). גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . אפיון מולקולרי של המודל התרבות עצביים מבודד. קטעים של הרפובליקה כולו היו immunolabeled עם נוגדנים נגד peripherin וβ-טובולין מראה ביטוי סלקטיבי משני סמנים subpopulations שני של נוירונים ganglionic. Peripherin (אדום) מתבטאת הנוירונים "קטן, אור", β-טובולין (ירוק) מתבטאת הנוירונים "גדול, כהה". צביעת הכסט מזוהה בעיקר את המיקום של הגרעינים בלוויין גליה בתוך גנגליון (א). האינטראקציה תא נוירון-לוויין ניתן לאבחן טוב יותר לאחר התא מלא דיסוציאציה טכניקה (B). הנה אנחנו מראים גוף עצביים חושית β-טובולין-חיוביות ו neurites שלה המוקף בלוויין גלייה (Hoechst: גרעינים, כחול). גודל ברים, A = 100 מיקרומטר; B = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . חקירה של HSV-1 מודל ערך ב DRG-derived הפומבית תאים. זיהום HSV-1 של חלופה מועדפת תאים הלוויין מתואר לאורך neurites β-טובולין-חיוביות (ירוק) מתגלה באמצעות נוגדן אנטי ויראלית דיינמיקס (אדום). לוויין גלייה הגרעינים הם מוכתם כחול עם Hoechst (א). הנוגדן אותו מגלה נגיפי כניסה בנוירונים הפומבית DRG (B). תאים הם במשותף עם תוויות עם נוגדן נגד הפאראן גופרתי (HS, ירוק) הביע על קרום התא. HS גם מרכיב מטריצה חוץ-תאית (ירוק), ממלא תפקיד חשוב לצמיחה עצב (C). נוירונים מסומנות עם peripherin (אדום) בעוד Hoechst הכחול משמש לזיהוי גרעינים של לוויין התא. גודל ברים = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המודל DRG ex-vivo הוא מאוד שימושי לחקור מגוון רחב של אירועים כגון אינטראקציה נוירון-עכשיו, דונלד, כמו גם השפעת microenvironment על שני החומרים עצביים, גליה37. עוד, DRG-המודל יכול לשמש ככלי חסכונית כדי לטפל שאלות רלוונטיות לגבי מנגנון פתוגניים ומקושרת סמנים על ידי פיתוח ex- vivo מערכות בשלב כרוני, החבויים חריפה של זיהום או מחלה נתונה. בנוסף, ספרייה ההקרנה של מולקולות קטנות ב DRG explants יכול לנצל את מודל explant זה של פיתוח תרופות. במבחנה מודלים, במיוחד מערכות תא בודד, לעיתים פשטני מדי תשבחות אירועים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית; בעוד ויוו מודלים מאתגרת כדי בדיוק לתפעל, חלקית בגלל התגובה החיסונית פגיעה הצטלקות גליה, את המורכבות ECM שמסביב יחד עם ההוצאה הפיננסית. לעומת זאת, explant DRG היא תרבות organotypic המאפשר שמחוץ העברה של איבר שלם עם המורכבות של רשת עצביים, כולל את microenvironment חוץ-תאית, שמשחק תפקיד משמעותי כל עצביים, גליה פונקציות. אולם, הדור של דגם ex-vivo יכול רק דומה אבל לא לגמרי לגמול את כל התנאים נמצאו בתוך vivo. שתי מגבלות חשוב לזכור בעת שימוש במודל זה העיתוי, העדר של פידבקים מערכתית, אשר רק שבאמת תוכל להיות מיוצג vivo בתוך. הזמן מוגבל כי הרפובליקה יכול להישמר חיוני שמחוץ הופך את המודל הזה מתאים יותר לחקירה של תנאים חריפה ובכך לא מודל מאוד אמין עבור מצבים כרוניים. בדומה, הדגם ex-vivo הוא לא אידיאלי עבור מחקרים עשוי להעשות על ידי העדר תגובות מערכות (למשל, מערכת החיסון) או איברים אחרים.
הצלחנו לבודד את explant ex-vivo DRG מ הן למבוגרים והן העובר עכברים וחולדות ולהשתמש בהצלחה מודל זה לחקור זיהום HSV-1, כמו גם מספר היבטים אחרים של והנוירולוגיה הפלסטית ואת השפעותיו על translational רפואה. על מנת לאפשר סיבי חישה לגדול בחוץ explant, הקפסולה שמסביב חיבור היה שהוסר חלקית1.
כדי להיות נחשב, התערובת ז'לטין חלבון המופק Engelbreth-הולם-נחיל (EHS) העכבר isrich sarcom, ב- ECM חלבונים כגון laminin, קולגן הרביעי, הפרין סולפאט proteoglycans (HSPG) מספר גורמי גדילה38. פרוטוקול זה, תערובת חלבונים כמו ג'לי הוא מדולל 1:1 עם תרבות בינוני, רשאית פולימריזציה למשך 30-60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת הנפח הסופי של המדיום. תערובת חלבונים כמו ג'לי polymerizes בטמפרטורת החדר; לכן, הוא הציע לקרר את התערובת עד explants הם מצופה להשתמש פיפטה קר טיפים כדי להפיץ µL 10-20 טיפות על גבי הכלים 12-. טוב. התזמון הוא קריטי עבור יעילות הסופית של ההליך תרבות והם עשויים להשתנות בהתאם לסוג (ייצור) של תערובת חלבונים כמו ג'לי בשימוש. אם התערובת חלבון כמו ג'לי לא polymerized לגמרי או שזה כבר הוא פני השטח למוצק, explant יכול לצוף או לייבש מובילים לצמיחה לא מוצלח. אנו מעודדים חוקרים מדעית לקבוע את הטמפרטורה המתאימה, זמן, דילול תערובת חלבונים כמו ג'לי עבור מודל מוצלח. . הגענו 55-70% יעילות של גידול מוצלח של explants DRG מתוחזק שמחוץ במשך 7-10 ימים. Explant יכול להיות הפומבית נוסף DRG-derived העיקרי חושית נוירונים ותאי בלוויין שותף לתרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין גילוי.
Acknowledgments
אנו מודים הדמיה הליבה-המתקן ב אוניברסיטת נברסקה (MWU) לבין הקבוצה של תלמידים [Chanmoly סנג, כריסטופר Dipollina, דריל Giambalvo ואת קייסי Sigerson] על תרומתם של תרבית תאים והדמיה עבודה. עבודת מחקר זו נתמכה על ידי גרנט Intramural של MWU מימון כדי M.F. ומחקר ראשונית V.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J.
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W.
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
