تقييم الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس تعتمد على الضغط في الشرايين المقاومة البشرية، والعيش بالفحص المجهري Fluorescence تسمية خالية
Summary
نحن تصف اختبار الميكانيكية المتزامنة وتصوير 3D الجدار الشرياني معزولة، يعيش الشرايين المقاومة البشرية، وتحليل الصورة إيلاستيك وفيجي للتحديد الكمي كثافات المنظمة وحجم المكانية الايلاستين والكولاجين. ونحن نناقش استخدام هذه البيانات في نماذج رياضية لميكانيكا الجدار الشرياني.
Abstract
يتم توثيق مساهمة المسببة للأمراض لإعادة عرض شريان المقاومة في ضروري ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري ومتلازمة الأيض. التحقيقات ووضع نماذج رياضية دافع ميكروستروكتورالي لفهم الخواص الميكانيكية للشرايين المقاومة الإنسان في الصحة والمرض كامنة للمساعدة في فهم كيفية المرض والعلاجات الطبية تؤثر على الإنسان دوران الأوعية الدقيقة. لتطوير هذه النماذج الرياضية، من الضروري أن فك العلاقة بين الخصائص الميكانيكية وميكروارتشيتيكتورال الجدار ميكروفاسكولار. في هذا العمل، ويصف لنا طريقة السابقين فيفو لاختبار الميكانيكية السلبي وتصوير خالية من تسمية ثلاثية الأبعاد المتزامنة المصغرة من الايلاستين والكولاجين في الجدار الشرياني للشرايين المقاومة البشرية المعزولة. يمكن تطبيق البروتوكول التصوير لمقاومة الشرايين لأي نوع من الفائدة. تحليل الصورة موصوفة للتحديد الكمي ط) الضغوط الناجمة عن التغيرات في الصفيحة المرنة الداخلية الزوايا المتفرعة والاستقامة الكولاجين أدفينتيتيال استخدام كثافات المجلد الثاني) الكولاجين والايلاستين تحدد باستخدام البرمجيات إيلاستيك وفيجي. يفضل أن يتم تنفيذ جميع القياسات الميكانيكية والتصوير في الشرايين الحية، perfused، غير نهج بديل باستخدام معيار ضغط الفيديو-الفحص المجهري ميوجرافي في تركيبة مع التصوير بعد انتهاء التثبيت المضغوط إعادة السفن وناقش. هذا أسلوب بديل يوفر للمستخدمين مع خيارات مختلفة لتحليل النهج. مناقشة إدراج بيانات الميكانيكية والتصوير في نماذج رياضية لميكانيكا الجدار الشرياني، ويقترح تطوير في المستقبل وإضافات للبروتوكول.
Introduction
مساهمة المسببة للأمراض والآثار لإعادة عرض الشريان المقاومة موثقة في ضروري ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري ومتلازمة الأيض1،2،3،،من45. فك العلاقة بين الخصائص الميكانيكية وميكروارتشيتيكتورال من الجدار microvascular أمر ضروري لوضع نماذج رياضية لهذه الرابطة. سيؤدي إلى تحسين فهم عملية إعادة عرض هذه النماذج وسيدعم التنمية في السيليكون نماذج مفيدة لاختبار استراتيجيات الدوائية تستهدف الأمراض المتصلة بإعادة عرض الجدار الشرياني.
وركزت الدراسات السابقة في فهم كيف المصغرة للجدار الشرياني تتعلق بالميكانيكا الجدار الشرياني بإدماج تدابير الميكانيكية والمصغرة المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتجري حصرا تقريبا على كبير ، الشرايين قناة مرنة من الفئران أو الخنازير6،،من78،9،،من1011. عادة يتم تصوير المجهرية للجدار باستخدام التقنيات البصرية غير الخطية، مع استفادة أوتوفلوريسسينسي الايلاستين وجيل التوافقي الثاني بالكولاجين. وهذا ما يسمح تصوير الزمانية المكانية لعنصرين رئيسيين المصفوفة خارج الخلية، والايلاستين والكولاجين، دون حاجة إلى تلطيخ. تصوير الجدار الشرياني في سمك كامل يمثل تحديا في الشرايين قناة كبيرة بسبب تشتت الضوء في وسائل الإعلام الغلالة السميكة. ومع ذلك، لتحديد كيف تتصل المصغرة للعناصر الهيكلية للجدار الشرياني الخواص الميكانيكية الملاحظة، معلومات ثلاثية الأبعاد يجب الحصول على أثناء اختبار الميكانيكية. للشرايين الكبيرة مثل الاورطي البشرية، وهذا يتطلب تركيب بياكسيال واختبار الميكانيكية والتصوير من المناطق ذات الاهتمام في 1-2 سم2 قطعة من الجدار الشرياني7،،من910، 12-يمكن تصويرها سوى جزء من الجدار واختبرت ميكانيكيا.
للشرايين أصغر من أي الأنواع (مثلاً، التامور البشرية13و الرئوية14 والشرايين تحت الجلد15 ، الفئران الشرايين المساريقي العلوي16،،من1718، 19 , 20، الماوس cremaster، المساريقي العلوي، والدماغية، والفخذ والشرايين السباتي21،،من2223،،من2425،26، من الممكن تصوير 27) من سمك الجدار كامل ويمكن دمجها مع اختبار الميكانيكية. يسمح هذا التسجيل المتزامن للخواص الميكانيكية والترتيبات الهيكلية داخل الجدار. ومع ذلك، نمذجة رياضية مباشرة العلاقة بين التعديلات الملحوظة في هيكل ثلاثي الأبعاد إدارة المحتوى في المؤسسة وتغيير الخصائص الميكانيكية لمقاومة الجدار الشرياني، إلى أفضل معرفتنا فقط أبلغ عند مؤخرا في المقاومة البشرية الشرايين13،15.
ويرد في هذا العمل، أسلوب السابقين فيفو لاختبار الميكانيكية السلبي وتصوير ثلاثي الأبعاد المتزامنة المصغرة من الايلاستين والكولاجين في الجدار الشرياني للشرايين المقاومة البشرية المعزولة. يمكن تطبيق البروتوكول التصوير لمقاومة الشرايين لأي نوع من الفائدة. ويرد تحليل الصورة الحصول على مقاييس الزوايا المتفرعة الداخلية الصفيحة المرنة والكولاجين أدفينتيتيال الاستقامة13 استخدام فيجي28. وأخيراً، نوقشت إدراج بيانات الميكانيكية والتصوير في نماذج رياضية لميكانيكا الجدار الشرياني وكثافة حجم الكولاجين والايلاستين مصممون على استخدام البرمجيات إيلاستيك29 .
ولاحظ هدف واصفاً التحليلات التصوير والصورة تقنيات في تركيبة مع النمذجة الرياضية تزويد المحققين نهج المنهجي لوصف وفهم الضغوط الناجمة عن التغييرات في إدارة المحتوى المؤسسي لمقاومة الشرايين. وتركز الأسلوب المبين في قياس التغيرات التي طرأت إدارة المحتوى في المؤسسة في سفينة أثناء الضغط، بمقارنة هيكل إدارة المحتوى في المؤسسة في 20 و 40 و 100 ملم زئبق. وقد اختيرت هذه الضغوط لتحديد هيكل الجدار الشرياني في أكثر متوافقة (20 ملم زئبق) وقاسية (100 ملم زئبق) والمتوسطة (40 ملم زئبق) الدولة، على التوالي. ومع ذلك، أي عملية في جدار الأوعية الدموية للشرايين الحية، بما في ذلك التغيرات التي تحدثها المكونات فعال في الأوعية والتباطؤ والتدفق، يمكن قياسها كمياً، اعتماداً على فرضية البحث في السؤال قبل المحقق.
ويشدد على استخدام الإثارة اثنين-فوتون fluorescence مجهرية (تبيم) في تركيبة مع ميوجراف ضغط لدراسة الضغط (أو غيرها) الناجمة عن التغييرات في إدارة المحتوى في المؤسسة الشرايين الحية. أولاً، لأن هذا يسمح باقتناء المتزامن لهيكل ثلاثي الأبعاد الشاملة للجدار الشرياني (سمك الجدار وقطرها) جنبا إلى جنب مع اكتساب خالية من تسمية ثلاثية الأبعاد ذات جودة عالية، مفصلة الصور الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس ك وصف13 بالاستفادة من أوتوفلوريسسينسي الايلاستين والكولاجين الثاني جيل التوافقي إشارة (SHG)30. ثانيا، يسمح تبيم هو السماح باستخدام الضوء الطاقة المنخفضة القريبة من الأشعة تحت الحمراء الإثارة، والتقليل إلى أدنى حد د من الأنسجة ومن ثم تصوير متكررة في نفس الموقف داخل جدار الأوعية الدموية، لاحظ يسمح تحليل القياسات المتكررة التغييرات.
هو مناقشة استخدام نهج بديل باستخدام التصوير [كنفوكل] لضغط ثابت الشرايين للسماح للمستخدمين دون الوصول إلى تبيم فرصة لاستخدام أسلوب وصف كذلك. يمكن أيضا استرداد المعلومات المتعلقة بإدارة المحتوى في المؤسسة هيكل وحجم الكثافة من تحليلات ثنائي الأبعاد للأنسجة مقطوع في المسلسل، مثلاً كما هو موضح من31،32. ومع ذلك، نظراً لعدم وجود إمكانية لاسترداد المعلومات الهيكلية ثلاثي الأبعاد عبر جداول طول الشريان وكذلك أثناء تغيير شروط استخدام هذا الأسلوب، أنها لا نوصي باستخدام هذا النهج للتحقيقات للضغط و المعاملة الناجمة عن التغييرات ثلاثية الأبعاد في إدارة المحتوى في المؤسسة.
الحد الأدنى لمتطلبات المحقق لتطبيق الأسلوب الموصوفة هنا هو الوصول إلى إعداد كانوليشن والضغط في الشرايين في تركيبة مع مجهر الأسفار إثارة [كنفوكل] أو اثنين-فوتون. الإعداد المبينة في البروتوكول التالي ميوجراف ضغط مبنية خصيصا مع محول قوة طولية، بنيت لتناسب على مجهر الأسفار مخصص بنيت مقلوب اثنين-فوتون إثارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمثل هذا العمل لدينا اقتراح موحد، والجمع بين التصوير والضغط ميوجرافي نهجاً، قيمة لتقييم الخواص الميكانيكية لمقاومة الشرايين والتغييرات ذات الصلة بالضغط في هيكل الشرياني المتزامن الجدار أكثر من مجموعة ضغط من 0 إلى 100 ملم زئبق. وضعت النهج المقدمة باستخدام معدات مخصصة بنيت، بيد أي ميوجراف …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون مركز التصوير الطبية الحيوية الجزيئية الدانمركية في “كلية العلوم الطبيعية”، جامعة جنوب الدنمارك، لاستخدام المختبرات والمجاهر. يعترف روسينستاند Kristoffer والعلا ملكيور للمساعدة التقنية الممتازة مع الضغط ميوجرافي والتصوير.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
Referências
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
