הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ
Summary
אנו לתאר בדיקות מכניות בו זמנית, 3D-הדמיה של העורקים בדופן מבודדים, לחיות ההתנגדות האנושית העורקים, וניתוחים פיג’י, Ilastik התמונה עבור כימות של אלסטין וקולגן המרחבי הארגון ונפח צפיפות. נדון השימוש של נתונים אלה במודלים מתמטיים של קיר עורקי מכניקה.
Abstract
התרומה פתוגניים של עמידות העורק שיפוץ מתועדת חיוני יתר לחץ דם, סוכרת, התסמונת המטבולית. חקירות ופיתוח מודלים מתמטיים microstructurally מוטיבציה להבנת התכונות המכאניות של העורקים ההתנגדות האנושית מחלה ובריאות יש פוטנציאל לסייע להבין כיצד מחלות וטיפולים רפואיים להשפיע את microcirculation אנושי. כדי לפתח מודלים מתמטיים האלה, זה חיוני כדי לפענח את הקשר בין המאפיינים מכני ו המיקרו-ארכיטקטוני של הקיר microvascular. בעבודה זו, אנו מתארים שיטה שמחוץ עבור בדיקות מכניות פסיבי, בו זמנית ללא תווית תלת מימדי הדמיה של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן בקיר עורקי עורקי התנגדות אנושית מבודדת. פרוטוקול הדמיה ניתן ליישם התנגדות העורקים של כל מין עניין. ניתוח התמונה מתוארים לכימות תנועת i) לחץ-induced שינויים זוויות הסתעפות פנימית פרופריה אלסטי וכן קולגן adventitial יושר באמצעות פיג’י צפיפויות כרך ii) קולגן ואלסטין נקבע באמצעות תוכנת Ilastik. רצוי כל המדידות מכני, דימות מבוצעות על העורקים בשידור חי, perfused, עם זאת, גישה חלופית באמצעות לחץ וידאו-מיקרוסקופ רגיל myography בשילוב עם קיבוע שאחרי הדמיה של כלי מווסת מחדש דנו. זו שיטה חלופית מספק למשתמשים עם אפשרויות שונות עבור ניתוח הגישות. ההכללה של הנתונים מכני, הדמיה במודלים מתמטיים של המכניקה קיר עורקי הנדונה, פיתוח עתידי ותוספות בפרוטוקול מוצעים.
Introduction
התרומה פתוגניים ואת ההשפעות של עמידות העורק שיפוץ מתועדים חיוני יתר לחץ דם, סוכרת, תסמונת מטבולית1,2,3,4,5. לפענח את הקשר בין המאפיינים מכני ו המיקרו-ארכיטקטוני של הקיר microvascular חיוני לפיתוח מודלים מתמטיים של עמותה זו. מודל שכזה לשפר את הבנת תהליך שיפוץ, יתמוך ההתפתחות במודלים silico שימושי לבדיקת אסטרטגיות תרופתי מיקוד מחלות הקשורות שיפוץ של הקיר עורקי.
מחקרים קודמים התמקדו בהבנת המיקרו-ארכיטקטורה של הקיר עורקי מתייחס מכניקה קיר העורק על ידי שילוב אמצעים מכניים וכיצד המיקרו-ארכיטקטורה של מטריצות (ECM) מבוצעות באופן כמעט בלעדי על גדול , צינור גמיש העורקים של עכברים או חזיר6,7,8,9,10,11. הדמיה של מזערים הקיר מתבצעת בדרך כלל באמצעות טכניקות אופטית לא-ליניאריות, מנצל autofluorescence של אלסטין, הדור השני הרמונית על ידי קולגן. פעולה זו מאפשרת הדמיה זמן-מרחבי של שני מרכיביה העיקריים של מטריצה חוץ-תאית, אלסטין קולגן, ללא צורך מכתים. הדמיה של הקיר עורקי בעובי מלא הוא אתגר בתוך צינור גדול עורקים עקב פיזור של האור בתקשורת tunica עבה. עם זאת, כדי לקבוע כיצד המיקרו-ארכיטקטורה של הרכיבים המבניים של הקיר עורקי להתייחס התכונות המכאניות נצפתה, יש להשיג מידע תלת מימדי במהלך הבדיקה מכני. עבור עורקים גדולים כמו העורקים אנושי, זה דורש הרכבה biaxial, מכני בדיקות הדמיה של אזורים עניין ב- 1-2 ס מ2 חתיכות של עורקי קיר7,9,10, 12. רק חלק הקיר יכול להיות עם תמונה ונבדק באופן מכני.
עבור עורקים קטנים יותר של כל מין (למשל, סביב הלב האנושי13, ריאתי14 ותת עורית15 העורקים, עכברוש העורקים מצע המעי העליון16,17,18, 19 , 20, העכבר cremaster, מצע המעי העליון, מוחי, הירך ואת עורק21,22,23,24,25,26, 27) הדמיה של עובי קיר שלם הינה אפשרית, יכול להיות משולב עם בדיקות מכניות. דבר זה מאפשר הקלטה בו זמנית של תכונות מכאניות, הסידורים מבניים בתוך הקיר. עם זאת, מידול מתמטי ישירה של יחסי הגומלין בין השינויים שנצפו במבנה תלת מימדי של ECM שהשתנו תכונות מכניות של הקיר עורקי ההתנגדות, לפי מיטב ידיעתנו רק דווחה על לאחרונה, ההתנגדות האנושית העורקים13,15.
בעבודה זאת, מתוארת שיטה שמחוץ עבור בדיקות מכניות פסיבי, הדמיה תלת מימדי בו זמנית של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן בקיר עורקי עורקי התנגדות אנושית מבודדת. פרוטוקול הדמיה ניתן ליישם התנגדות העורקים של כל מין עניין. ניתוח התמונה מתוארים להשגת למדידת זוויות הסתעפות פנימית פרופריה אלסטי, יושר קולגן adventitial13 באמצעות פיג’י28. צפיפות האחסון קולגן ואלסטין נקבעים באמצעות תוכנת Ilastik29 ונדון בסופו של דבר, ההכללה של הנתונים מכני, הדמיה במודלים מתמטיים של המכניקה קיר העורק.
מטרתו לתאר את הבדיקות לדימות ותמונה טכניקות בשילוב עם מודלים מתימטיים היא לספק החוקרים בגישה שיטתית כדי לתאר ולהבין נצפו שינויים בלחץ המושרה ה-ECM של התנגדות העורקים. השיטה המתוארת מתמקדת ב לכימות השינויים ECM מגרגרי בזמן לחץ, על-ידי השוואת מבנה ה-ECM-20, 40 ו- 100 מ מ כספית. הלחצים הללו נבחרו לקביעת המבנה של החומה העורקים שלו תואם יותר (20 מ מ כספית), נוקשה (100 מ מ כספית) ומצב ביניים (40 מ מ כספית), בהתאמה. עם זאת, כל תהליך בדופן כלי הדם העורקים בשידור חי, כולל שינויים המושרה על ידי רכיבים vasoactive, היסטרזיס וזרימה, ניתן לכמת, בהתאם ההשערה במחקר המדובר על-ידי החוקר.
השימוש של שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (TPEM) בשילוב myograph לחץ לשינויים לומד לחץ (או השני) הנגרמת ב- ECM העורקים בשידור חי מודגשת. קודם כל, כי זה מאפשר רכישת סימולטני של מבנה תלת-ממדי הכולל של החומה עורקי (קוטר וקיר עובי) יחד עם רכישת תלת-ממדי ללא תווית של איכות גבוהה, מפורט תמונות של קולגן, אלסטין microarchitectures כמו שמתואר13 על-ידי ניצול של autofluorescence של אלסטין, קולגן השני דור הרמונית אות (SHG)30. שנית, TPEM מאפשר שימוש של אור אנרגיה נמוכה-סגול עירור, מזעור נזקי של רקמות, לפיכך, הדמיה חוזרות ונשנות-בדיוק באותה התנוחה בתוך קיר וסקולרית מותרת, המתיר ניתוח מדידות חוזרות של שנצפו שינויים.
השימוש בגישה אלטרנטיבית באמצעות הדמיה קונאפוקלית של לחץ קבוע העורקים נדון כדי לאפשר למשתמשים ללא גישה TPEM הזדמנות להשתמש בשיטה המתוארת גם כן. גם ניתן יהיה לאחזר מידע על צפיפות במבנה ונפח ECM מניתוחי דו-ממדית של רקמות למחלקה של יציאה טורית, למשל כפי שמתואר על ידי31,32. עם זאת, בשל היעדר אפשרות לאחזר נתוני מבנה תלת-ממדי על המאזניים אורך של העורק, כמו גם במהלך שינוי תנאי השימוש בשיטה זו, זה לא מומלץ שימוש בגישה זו החקירות של לחץ, טיפול המושרה תלת מימדי לשינויים ECM.
הדרישה המינימלית עבור החוקר להחיל את שיטת המתוארים במסמך זה היא הגישה אל מלכודת תעלות, לחץ עורקי בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית. ההגדרה תיאר בפרוטוקול הבא תהיה myograph לחץ לפי הזמנה עם מתמר כוח האורך, שנבנה כדי להתאים מיקרוסקופ פלורסצנטיות עירור מותאם אישית שני הפוטונים בנוי הפוכה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מייצגת את ההצעה שלנו עבור סטנדרטית בשילוב הדמיה ואת הלחץ myography גישה, יקר עבור הערכה בו זמנית של התכונות המכאניות של התנגדות העורקים ושינויים הקשורים ללחץ במבנה של העורקים קיר על טווח הלחץ בין 0 ל- 100 מ מ כספית. הגישה הציג פותחה תוך שימוש בציוד בנוי מותאם אישית, עם זאת, כל myograph לחץ מתאי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה דנית מולקולרית ביו-רפואית במרכז-הפקולטה למדעי הטבע, באוניברסיטת דרום דנמרק, לשימוש של מעבדות ומיקרוסקופים. כריסטופר Rosenstand, אולה מלכיאור הם הכירו לסיוע טכני מעולה עם הלחץ myography, הדמיה.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
Referências
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
