Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie
Summary
We beschrijven gelijktijdige mechanische testen en 3D-imaging van de arteriële muur van geïsoleerd levende menselijke weerstand slagaders, en Fiji en Ilastik analyses van de afbeelding voor de kwantificering van elastine en collageen ruimtelijke organisatie en volume dichtheden. We bespreken het gebruik van deze gegevens in wiskundige modellen van arteriële muur mechanica.
Abstract
De pathogene bijdrage aan het remodelleren van de slagader van de weerstand wordt beschreven in essentiële hypertensie, diabetes en het metabool syndroom. Onderzoek en ontwikkeling van microstructurally gemotiveerd wiskundige modellen voor het begrijpen van de mechanische eigenschappen van menselijke weerstand slagaders in gezondheid en ziekte hebben het potentieel om te helpen begrijpen hoe ziekte en medische behandelingen invloed op de menselijke microcirculatie. Ontwikkeling van deze wiskundige modellen, is het essentieel om te ontcijferen van de relatie tussen de eigenschappen van het mechanische en microarchitectural van de microvasculaire muur. In dit werk beschrijven we een ex vivo -methode voor het passieve mechanische testen en gelijktijdige label-free driedimensionale beeldvorming van de microarchitectuur van elastine en collageen in de arteriële muur van geïsoleerde menselijke weerstand slagaders. Het imaging protocol kan worden toegepast op weerstand slagaders van elke soort van belang. Beeld analyses worden beschreven voor het kwantificeren van i) druk-geïnduceerde veranderingen in interne elastische lamina vertakkende hoeken en adventitial collageen rechtheid met behulp van Fiji en ii) collageen en elastine volume dichtheid bepaald met behulp van de Ilastik software. Bij voorkeur alle mechanische en imaging metingen worden uitgevoerd op live, geperfundeerd slagaders, is echter een alternatieve aanpak met behulp van video-microscopie standaarddruk myography in combinatie met na fixatie beeldvorming van opnieuw onder druk staande schepen besproken. Deze alternatieve methode biedt gebruikers met verschillende opties voor analyse benaderingen. De opname van de mechanische en imaging gegevens in wiskundige modellen van de arteriële muur mechanica wordt besproken, en toekomstige ontwikkeling en toevoegingen aan het protocol worden voorgesteld.
Introduction
De pathogene bijdrage en de gevolgen van het remodelleren van de slagader van de weerstand worden beschreven in essentiële hypertensie, diabetes en het metabool syndroom1,2,3,4,5. Ontcijferen van de relatie tussen de eigenschappen van het mechanische en microarchitectural van de microvasculaire muur is essentieel voor de ontwikkeling van wiskundige modellen van deze vereniging. Dergelijke modellen inzicht in het remodelleert proces zal verbeteren en de ontwikkeling van in silico modellen handig voor het testen van farmacologische strategieën gericht op ziekte gerelateerde remodelleren van de arteriële muur zullen steunen.
Voorafgaande studies gericht in het begrip van hoe de microarchitectuur van de arteriële muur heeft betrekking op arteriële muur mechanica door mechanische maatregelen te nemen en de microarchitectuur van de extracellulaire matrix (ECM) worden bijna uitsluitend uitgevoerd op grote , elastische conduit slagaders van muizen of varkens6,7,8,9,10,11. Beeldvorming van de microstructuren van de muur worden doorgaans uitgevoerd met behulp van niet-lineaire optische technieken, profiteren van de autofluorescence van elastine en tweede-harmonische generatie door collageen. Hierdoor Spatio beeldvorming van de twee belangrijke componenten van de extracellulaire matrix, elastine en collageen, zonder behoefte aan een kleuring. Beeldvorming van de arteriële muur in volledige dikte is een uitdaging in grote conduit slagaders als gevolg van de spreiding van het licht in de dikke tunica media. Echter, om te bepalen hoe de microarchitectuur van de structurele onderdelen van de arteriële muur zich verhouden tot de waargenomen mechanische eigenschappen, driedimensionale informatie moet worden verkregen tijdens de mechanische testen. Voor grote slagaders zoals de menselijke aorta hiervoor biaxial montage, mechanische testen en beeldvorming van gebieden van belang in 1-2 cm2 stukken van de arteriële muur7,9,10, 12. slechts een deel van de muur kan worden beeld en mechanisch getest.
Voor kleinere slagaders van elke soort (bijvoorbeeld, menselijke pericardvocht13, pulmonale14 en subcutane15 slagaders, rat mesenterische slagaders16,17,18, 19 , 20, muis cremaster, lymfklieren, cerebrale, femur en halsslagaderen21,22,23,24,25,26, 27) beeldvorming van de gehele wanddikte is mogelijk en kan gecombineerd worden met mechanische testen. Hierdoor wordt gelijktijdige opname van de mechanische eigenschappen en de structurele regelingen binnen de stadsmuur. Echter is een directe wiskundige modellering van de relatie tussen de waargenomen veranderingen in de driedimensionale structuur van de ECM en gewijzigde mechanische eigenschappen van de arteriële muur van verzet, om het beste van onze kennis alleen gemeld op recent in de menselijke weerstand slagaders13,15.
In dit werk, wordt een ex vivo voor passieve mechanische testen en gelijktijdige driedimensionale beeldvorming van de microarchitectuur van elastine en collageen in de arteriële muur van geïsoleerde menselijke weerstand slagaders beschreven. Het imaging protocol kan worden toegepast op weerstand slagaders van elke soort van belang. Beeld analyses worden beschreven voor het verkrijgen van de maatregelen van interne elastische lamina vertakkende hoeken en adventitial collageen rechtheid13 met behulp van Fiji28. Collageen en elastine volume dichtheden worden bepaald met behulp van de Ilastik software29 en ten slotte de opname van de mechanische en imaging gegevens in wiskundige modellen van de arteriële muur mechanica wordt besproken.
Het doel van het beschrijven van de beeldvorming en beeld analyses technieken in combinatie met wiskundige modellering is bedoeld als onderzoekers een planmatige aanpak om te beschrijven en te begrijpen waargenomen druk geïnduceerde veranderingen in de ECM van weerstand slagaders. De beschreven methode is gericht op het kwantificeren van de veranderingen in de ECM in een vaartuig tijdens drukregeling, door het vergelijken van de structuur van de ECM bij 20, 40 en 100 mmHg. Deze druk werden gekozen voor de bepaling van de structuur van de arteriële muur op de meer compatibele (20 mmHg), de stijf (100 mmHg) en de intermediaire (40 mmHg) status, respectievelijk. Echter kan een proces in de vasculaire muur van levende slagaders, met inbegrip van wijzigingen veroorzaakt door vasoactieve onderdelen, hysteresis en stroom, worden gekwantificeerd, afhankelijk van de onderzoek-hypothese in kwestie door de onderzoeker.
Het gebruik van twee-foton excitatie fluorescentie microscopie (TPEM) in combinatie met een druk myograph voor studeren druk (of andere) veroorzaakte veranderingen in de ECM van levende slagaders wordt benadrukt. Ten eerste, omdat hierdoor gelijktijdige overname van de totale driedimensionale structuur van de arteriële muur (diameter en muur dikte) samen met driedimensionale label-vrije verwerving van hoge kwaliteit, gedetailleerde beelden van de collageen en elastine microarchitectures als beschreven13 door te profiteren van de elastine-autofluorescence en de collageen tweede harmonische generatie signaal (SHG)30. Ten tweede, TPEM maakt gebruik van lage-energie nabij-infrarood excitatie licht, minimaliseren van photodamage van het weefsel en dus herhaalde beeldvorming op precies dezelfde positie binnen de vasculaire muur is toegestaan, executoriale herhaald-metingen analyses van waargenomen wijzigingen.
Het gebruik van een alternatieve aanpak met behulp van de confocal beeldvorming van druk vaste slagaders wordt besproken zodat gebruikers zonder toegang tot TPEM kunnen gebruiken van de beschreven methode ook. Uit twee-dimensionale analyses van weefsels gesegmenteerd in seriële, bijvoorbeeld zoals beschreven door31,32kan ook informatie over ECM structuur en volume dichtheden worden opgehaald. Als gevolg van het ontbreken van de mogelijkheid tot drie-dimensionale structurele informatie ophalen over de schalen van de lengte van de slagader en tijdens het veranderende omstandigheden met behulp van deze methode, het is echter niet raden deze aanpak voor onderzoek van druk en behandeling geïnduceerde driedimensionale veranderingen in de ECM.
De minimale eis voor de onderzoeker de hierin beschreven methode toe te passen is de toegang tot een setup voor cannulation en drukregeling van de slagaders in combinatie met een confocal of twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop. De setup beschreven in het volgende protocol is een op maat gemaakte druk myograph met een longitudinale kracht transducer, built to fit op een aangepaste gebouwde omgekeerde twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk vertegenwoordigt onze suggestie voor een gestandaardiseerde, gecombineerde beeldvorming en druk myography aanpak, waardevol voor gelijktijdige evaluatie van de mechanische eigenschappen van weerstand slagaders en druk-gerelateerde veranderingen in de structuur van het arterial muur over een drukbereik van 0 tot 100 mmHg. De voorgestelde aanpak werd ontwikkeld met behulp van aangepaste ingebouwde apparatuur, echter druk myograph die op een twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop past kan worden gebruikt, wa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het Deens moleculaire Biomedical Imaging Center op de faculteit of Natural Sciences, Universiteit van Zuid-Denemarken, voor het gebruik van laboratoria en microscopen. Kristoffer Rosenstand en Ulla Melchior worden erkend voor uitstekende technische bijstand met de druk myography en imaging.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
Referências
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
