Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Wir beschreiben, gleichzeitige mechanische Prüfung und 3D-Bildgebung der Arterienwand vereinzelter, Leben, menschlichen Widerstand Arterien und Fidschi und Ilastik Bild-Analysen für die Quantifizierung von Elastin und Kollagen räumliche Organisation und Volumen Dichte. Wir diskutieren die Verwendung dieser Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik.
Abstract
Die pathogene Beitrag der Widerstand Arterie Umgestaltung ist essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom urkundlich erwähnt. Untersuchungen und die Entwicklung des microstructurally motiviert mathematische Modelle für das Verständnis der mechanischen Eigenschaften des menschlichen Widerstand Arterien in Gesundheit und Krankheit haben das Potential zum besseren Verständnis wie Krankheit und medizinische Behandlungen Auswirkungen auf die menschliche Mikrozirkulation. Um diese mathematische Modelle zu entwickeln, ist es wichtig, die Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand zu entschlüsseln. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige markierungsfreie dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen werden für die Quantifizierung i) Druck-induzierte Veränderungen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit mit Fidschi und (Ii) Kollagen und Elastin Volumen Dichte bestimmt, mit Ilastik-Software beschrieben. Vorzugsweise alle mechanischen und imaging sind Messungen auf live, PERFUNDIERTEN Arterien, jedoch ist ein alternativer Ansatz mit standard Video-Mikroskopie Druck Myographie in Kombination mit Post-Fixierung Bildgebung der erneut unter Druck stehenden Behälter diskutiert. Diese alternative Methode bietet dem Anwender mit verschiedenen Optionen für Analyse-Ansätze. Die Einbeziehung der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert, und zukünftige Entwicklung und Ergänzungen des Protokolls werden vorgeschlagen.
Introduction
Die pathogenen Beitrag und Auswirkungen der Widerstand Arterie Umgestaltung sind essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom1,2,3,4,5dokumentiert. Entschlüsselung der Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand ist unerlässlich für die Entwicklung mathematischer Modelle dieses Vereins. Solche Modelle verbessert den Umbau Prozess zu verstehen und unterstützen die Entwicklung der in Silico Modellen pharmakologische Strategien zielen Krankheit im Zusammenhang mit Umbau der Arterienwand zu Testzwecken nützlich.
Vorherige Studien konzentrierten sich im Verständnis der Mikroarchitektur der Arterienwand bezieht sich auf die Arterienwand Mechanik durch den Einbau von mechanischen Maßnahmen und der Mikroarchitektur der extrazellulären Matrix (ECM) werden fast ausschließlich auf große durchgeführt , elastische Conduit Arterien von Mäusen oder Schwein6,7,8,9,10,11. Bildgebung von Mikrostrukturen der Wand erfolgt in der Regel mit nichtlinearen optischen Techniken, unter Ausnutzung der Autofluoreszenz von Elastin und harmonische der zweiten Generation von Kollagen. Dadurch räumlich-zeitliche Darstellung der zwei wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix, Elastin und Kollagen, ohne Notwendigkeit einer Färbung. Bildgebung der Arterienwand in voller Stärke ist eine Herausforderung in großen Conduit Arterien durch Streuung des Lichts in den dicken Tunika-Medien. Aber, um festzustellen, wie der Mikroarchitektur der Strukturbestandteile der Arterienwand beziehen sich auf die beobachteten mechanischen Eigenschaften, dreidimensionale Informationen während der mechanischen Prüfung einzuholen. Für die großen Arterien wie die menschliche Aorta erfordert dies biaxialen Montage, mechanische Tests und imaging-Regionen von Interesse in 1-2 cm2 Stück der Arterienwand7,9,10, 12. nur einen Teil der Wand abgebildet und mechanisch getestet werden kann.
Für kleinere Arterien aller Arten (z. B. menschlichen Herzbeutel13, pulmonale14 und subkutane15 Arterien, Ratten mesenterialen Arterien16,17,18, 19 , 20, Maus Cremaster, mesenterialen, zerebrale, femorale und Halsschlagadern21,22,23,24,25,26, 27) Bildgebung der gesamte Wanddicke ist möglich und kombinierbar mit mechanischen Tests. Dies ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von der mechanischen Eigenschaften und die strukturellen Vorkehrungen innerhalb der Wand. Jedoch wurde eine direkte mathematische Modellierung des Verhältnisses zwischen der beobachteten Veränderungen in der dreidimensionalen Struktur des ECM und geänderten mechanischen Eigenschaften der Arterienwand Widerstand nach bestem Wissen und gewissen nur berichtet auf vor kurzem in menschlichen Widerstand Arterien13,15.
In dieser Arbeit wird eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien beschrieben. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen sind für den Erhalt der Maßnahmen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit13 mit Fidschi28beschrieben. Kollagen und Elastin Volumen Dichte werden mit Ilastik Software29 bestimmt und schließlich die Aufnahme der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert.
Das Ziel der Bildgebung und Bild Analysen Techniken in Kombination mit der mathematischen Modellierung soll Prüfern eine systematische Vorgehensweise zu beschreiben und zu verstehen, zu beschreiben beobachtet Druckänderungen induziert in den ECM Widerstand Arterien. Die beschriebene Methode konzentriert sich bei der Quantifizierung der Änderungen in das ECM in einem Gefäß während der Druckbeaufschlagung, durch den Vergleich der Struktur des ECM bei 20 / 40 / 100 MmHg. Diese Belastungen wurden ausgewählt, für die Bestimmung der Struktur der Arterienwand nachgiebiger (20 MmHg), steif (100 MmHg) und Zwischenzustand (40 MmHg), beziehungsweise. Jedoch kann jeder Prozess in der Gefäßwand der live Arterien, einschließlich Änderungen induziert durch vasoaktive Komponenten, Hysterese und Flow, abhängig von der Forschung-Hypothese in Frage durch den Prüfarzt quantifiziert werden.
Die Verwendung von zwei-Photon Erregung Fluoreszenz-Mikroskopie (TPEM) in Kombination mit einer Druck-Myograph für Studium Druck (oder andere) induziert Veränderungen in der ECM live Arterien wird betont. Erstens, weil das simultane Erfassung der insgesamt dreidimensionale Struktur der Arterienwand (Durchmesser und Wandstärke) sowie dreidimensionale markierungsfreie Erwerb von hoher Qualität ermöglicht, detaillierte Bilder von Kollagen und elastin Mikroarchitekturen wie beschrieben13 unter Ausnutzung die Autofluoreszenz Elastin und Kollagen zweite harmonische Erzeugung Signal (SHG)30. Zweitens ermöglicht TPEM Verwendung von Niedrigenergie-Nah-Infrarot-Anregungslicht, lichtbedingten der Gewebe und somit wiederholte Bildgebung an genau der gleichen Position innerhalb der Gefäßwand zu minimieren darf ermöglichen wiederholte Messungen Analysen beobachtet, Änderungen.
Die Verwendung eines alternativen Ansatzes mit konfokale Bildgebung des Drucks behoben Arterien wird besprochen, damit Benutzer ohne Zugriff auf TPEM Gelegenheit, sowie das beschriebene Verfahren verwenden können. Informationen zu Struktur und Volumen Dichte ECM kann auch aus zweidimensionalen Analysen der Gewebe geschnitten in Serie, z. B. wie beschrieben von31,32abgerufen werden. Aufgrund der fehlenden Möglichkeit zum Abrufen von dreidimensionalen Strukturinformationen über die Längenskalen der Arterie sowie bei wechselnden Bedingungen mit dieser Methode, ist es jedoch nicht empfehlen die Verwendung dieses Ansatzes für Untersuchungen von Druck und Behandlung induziert dreidimensionale Änderungen in das ECM.
Die Mindestanforderung für die Ermittler, die hierin beschriebene Methode anzuwenden ist der Zugriff auf ein Setup für Kanülierung und Druckbeaufschlagung der Arterien in Kombination mit einem konfokalen oder zwei-Photon Erregung-Fluoreszenz-Mikroskop. Die Einrichtung in das folgende Protokoll beschrieben ist ein Custom-Built Druck Myograph mit einer längs Kraftaufnehmer, gebaut, um auf eine benutzerdefinierte gebaute umgekehrten zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop passen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit stellt unser Vorschlag für eine standardisierte, kombinierte Bildgebung und Druck Myographie Ansatz, wertvoll für die gleichzeitige Prüfung der mechanischen Eigenschaften der Widerstand Arterien und der Druck im Zusammenhang mit Veränderungen in der Struktur der der arteriellen Wand über einem Druckbereich von 0 bis 100 MmHg. Das vorgestellte Konzept wurde entwickelt mit benutzerdefinierten gebauten Anlagen, jedoch Druck-Myograph, das passt auf eine zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop eingesetzt w…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den dänischen Molekulare Biomedical Imaging Center an der Fakultät für Naturwissenschaften, Universität von Süddänemark für die Nutzung von Labors und Mikroskope. Kristoffer Rosenstand und Ulla Melchior sind ausgezeichnete technische Unterstützung für den Druck Myographie und imaging anerkannt.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
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