Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre
Summary
Describimos prueba mecánica simultánea y proyección de imagen 3D de la pared arterial de aislados, viven las arterias de resistencia humana y Fiji y Ilastik análisis de imagen para la cuantificación de colágeno y elastina densidades organización y volumen espaciales. Discutimos el uso de estos datos en modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial.
Abstract
La contribución patógena de resistencia arteria remodelación está documentada en la hipertensión esencial, diabetes y síndrome metabólico. Investigaciones y desarrollo de modelos matemáticos microestructuralmente motivados para la comprensión de las propiedades mecánicas de las arterias de resistencia humana en salud y enfermedad tienen el potencial para ayudar a entender cómo la enfermedad y tratamientos médicos afectan la microcirculación humana. Para desarrollar estos modelos matemáticos, es fundamental para desentrañar la relación entre las propiedades mecánicas y microarquitectura de la pared microvascular. En este trabajo, describimos un método ex vivo para ensayos mecánicos pasivos y proyección de imagen tridimensional libre de sello simultánea de la microarquitectura de elastina y colágeno en la pared arterial de las arterias de resistencia humana aislada. El protocolo de imagen puede aplicarse a las arterias de resistencia de cualquier especie de interés. Análisis de imagen se describen para cuantificar cambios i) inducidos por la presión en los ángulos de ramificación lámina elástico interna y rectitud de colágeno adventicial con Fiji y densidades de volumen ii) colágeno y elastina determinadas utilizando el software de Ilastik. Preferentemente se realizan todas las mediciones mecánicas y proyección de imagen en vivas y perfusión de las arterias, sin embargo, es un método alternativo utilizando presión estándar de video-microscopía miografía en combinación con las imágenes posteriores a la fijación de los recipientes a presión discuten. Este método alternativo proporciona a los usuarios diferentes opciones de enfoques de análisis. Se discute la inclusión de los datos mecánicos y proyección de imagen de modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial, y se proponen adiciones al Protocolo y desarrollo futuro.
Introduction
La contribución patógeno y efectos de la resistencia de la arteria remodelación están documentadas en la hipertensión esencial, diabetes y síndrome metabólico1,2,3,4,5. Descifrar la relación entre las propiedades mecánicas y microarquitectura de la pared microvascular es esencial para el desarrollo de modelos matemáticos de esta asociación. Tales modelos mejorarán la comprensión el proceso de remodelación y apoyarán el desarrollo de modelos de silico útil para probar estrategias farmacológicas dirigidos a enfermedades relacionadas con el remodelado de la pared arterial.
Estudios previos centraron en la comprensión de cómo la microarquitectura de la pared arterial se refiere a la mecánica de la pared arterial mediante la incorporación de medios mecánicos y la microarquitectura de la matriz extracelular (ECM) se realizan casi exclusivamente en grandes , arterias del conducto elástico de ratones o porcina6,7,8,9,10,11. Proyección de imagen de las microestructuras de la pared se realiza generalmente mediante técnicas ópticas no lineales, aprovechando el autofluorescence de segunda generación armónica de elastina y de colágeno. Esto permite la proyección de imagen espacio-temporal de los dos principales componentes de la matriz extracelular, la elastina y el colágeno, sin necesidad de tinción. La proyección de imagen de la pared arterial espesor completo es un reto en las arterias grandes del conducto debido a la dispersión de la luz en el espesor de la túnica media. Sin embargo, para determinar cómo la microarquitectura de los componentes estructurales de la pared arterial se relacionan con las propiedades mecánicas observadas, deberá obtenerse información tridimensional durante la prueba mecánica. De las grandes arterias como la aorta humana, esto requiere montaje biaxial, pruebas mecánicas y proyección de imagen de regiones de interés en piezas de2 1-2 cm de la pared arterial7,9,10, 12. sólo una parte de la pared puede ser reflejada y probada mecánicamente.
Por arterias más pequeñas de cualquier especie (p. ej., pericárdico humano13, pulmonar14 y subcutánea15 arterias, rata arterias mesentéricas16,17,18, 19 , 20, ratón cremaster, mesentérica, cerebral, femoral y carótida arterias21,22,23,24,25,26, 27) proyección de imagen del espesor de la pared todo es posible y puede ser combinado con pruebas mecánicas. Esto permite la grabación simultánea de las propiedades mecánicas y los arreglos estructurales dentro de la pared. Sin embargo, una modelación matemática directa de la relación entre las alteraciones observadas en la estructura tridimensional de la ECM y cambiado las propiedades mecánicas de la pared arterial de la resistencia, se a lo mejor de nuestro conocimiento sólo ha divulgado sobre recientemente en las arterias de resistencia humana de13,15.
En este trabajo se describe un método ex vivo para ensayos mecánicos pasivos y simultánea proyección de imagen tridimensional de la microarquitectura de elastina y colágeno en la pared arterial de las arterias de resistencia humana aislada. El protocolo de imagen puede aplicarse a las arterias de resistencia de cualquier especie de interés. Análisis de imagen se describen para la obtención de medidas de los ángulos de ramificación lámina elástico interna y colágeno adventicial rectitud13 con Fiji28. Densidad de volumen de colágeno y elastina se determina usando Ilastik software29 y por último, se discute la inclusión de los datos mecánicos y proyección de imagen de modelos matemáticos de la mecánica de la pared arterial.
El objetivo de describir el análisis de la proyección de imagen y la imagen técnicas en combinación con modelos matemáticos es proporcionar a los investigadores un enfoque sistemático para describir y comprender la presión inducida por cambios observados en el ECM de las arterias de resistencia. El método descrito se centra en la cuantificación de los cambios en el ECM en un buque durante la presurización, mediante la comparación de la estructura de la ECM en 20, 40 y 100 mmHg. Estas presiones fueron elegidas para la determinación de la estructura de la pared arterial en su más obediente (20 mmHg), stiff (100 mmHg) y estado intermedio (40 mmHg), respectivamente. Sin embargo, cualquier proceso en la pared vascular de arterias vivas, incluyendo cambios inducidos por los componentes vasoactivos, histéresis y flujo, se puede cuantificar, dependiendo de la hipótesis de la investigación en cuestión por el investigador.
Se acentúa el uso de microscopía de fluorescencia de excitación de dos fotones (TPEM) en combinación con un miógrafo presión para estudiar la presión (u otro) inducida por cambios en el ECM de arterias vivo. En primer lugar, porque esto permite la adquisición simultánea de la estructura tridimensional global de la pared arterial (diámetro y espesor de pared) junto con la adquisición tridimensional libre de sello de alta calidad, detalladas imágenes del colágeno y elastina microarchitectures descrito13 aprovechando la autofluorescencia de la elastina y el colágeno segunda generación armónica señal (SHG)30. En segundo lugar, TPEM permite se permite el uso de luz infrarroja de baja energía excitación, minimizando el fotoenvejecimiento del tejido y por lo tanto, la proyección de imagen repetida en exactamente la misma posición dentro de la pared vascular, que permite análisis de mediciones repetidas de observar cambios.
Se discute el uso de un enfoque alternativo usando proyección de imagen confocal de presión fijada a las arterias para permitir a los usuarios sin acceso a TPEM la oportunidad de utilizar el método descrito así. Información sobre densidades de estructura y volumen de ECM también puede ser obtenido de análisis bidimensionales de los tejidos seccionados en serie, por ejemplo, como se describe en31,32. Sin embargo, debido a la falta de posibilidad de recuperar información estructural tridimensional mediante las escalas de la longitud de la arteria, así como durante el cambio de condiciones de uso de este método, es no es recomendable utilizar este enfoque para las investigaciones de presión y tratamiento indujo cambios tridimensionales en el ECM.
El requisito mínimo para el investigador aplicar el método aquí descrito es el acceso a una instalación de la canalización y la presurización de las arterias en combinación con un microscopio de fluorescencia confocal o dos fotones excitación. La configuración que se describe en el siguiente protocolo es un miógrafo a la medida de la presión con un transductor de fuerza longitudinal, construido para caber en un microscopio de fluorescencia invertido construido personalizado de la excitación de dos fotones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo representa nuestra sugerencia para un estandarizada combinada presión y proyección de imagen de miografía enfoque, valioso para la evaluación simultánea de las propiedades mecánicas de las arterias de resistencia y cambios en la estructura de la arterial relacionados con la presión pared en un rango de presión de 0 a 100 mmHg. El enfoque presentado fue desarrollado usando equipo construido personalizado, sin embargo, puede utilizarse cualquier miógrafo de presión que cabe en un microscopio de fluor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el danés biomédica Molecular Imaging Center en la Facultad de Ciencias naturales de la Universidad de Dinamarca Meridional, para el uso de laboratorios y microscopios. Kristoffer Rosenstand y Ulla Melchior son reconocidos por la excelente asistencia técnica con la presión miografía y proyección de imagen.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
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