Оценка коллаген и эластин схемотехнические зависящих от давления в артериях живой, человеческий сопротивления по микроскопии флуоресцирования Label бесплатно
Summary
Мы описать одновременное механическое тестирование и 3D-изображений артериальной стенки изолированных, жить артерий человеческого сопротивления и Фиджи и Ilastik анализа изображения для количественной оценки плотностей эластина и коллагена пространственной организации и объем. Мы обсуждаем использования этих данных в математических моделях артериальной стенки механики.
Abstract
Патогенные вклад сопротивления артерии ремоделирования документирован в гипертоническая болезнь, диабет и метаболически синдрома. Исследования и разработка microstructurally почве математических моделей для понимания механические свойства человеческого сопротивления артерий в здоровье и болезни имеют потенциал для оказания помощи понимание как болезни и лечение влияет на человека микроциркуляцию. Развивать эти математические модели, важно расшифровать отношения между свойства Механические и микроархитектуры микрососудистой стены. В этой работе мы описываем метод ex vivo для пассивного механических испытаний и одновременное лейбл бесплатно трехмерных изображений микроархитектуры эластина и коллагена в артериальной стенки артерий изолированных человеческое сопротивление. Визуализации протокол может применяться к артерии сопротивления любых видов, представляющих интерес. Анализ изображений описаны для количественной оценки i) давление индуцированные изменения в внутренней упругой пластинки ветвления углов и прямолинейности adventitial коллагена, используя Фиджи и плотности тома ii) коллагена и эластина, определяются с помощью программного обеспечения Ilastik. Желательно все механические и Тепловизионные измерения выполняются на живой, перфузии артерий, однако, альтернативный подход с использованием стандартных видео микроскопия давления миография в сочетании с после фиксации изображений повторно под давлением судов обсудили. Этот альтернативный метод предоставляет пользователям с различными опциями для анализа подходов. Обсуждается включение механических и визуализации данных в математической модели механики артериальной стенки, и предлагается будущего развития и дополнения к протоколу.
Introduction
Патогенных вклада и воздействия сопротивления артерии ремоделирования описаны в гипертоническая болезнь, диабет и метаболический синдром1,2,3,4,5. Расшифровка отношения между механические и микроархитектуры свойства стенку, Микроваскулярная имеет важное значение для разработки математических моделей этой ассоциации. Такие модели улучшат понимание процесса реконструкции и будет поддерживать развитие в silico модели полезен для тестирования фармакологических стратегии таргетинга болезни ремоделирования артериальной стенки.
Предыдущие исследования были сосредоточены в понимании того, как микроархитектура артериальной стенки относится к артериальной стенки механики, включив механические меры и микроархитектуры внеклеточного матрикса (ECM) выполняются почти исключительно на крупных , артерии упругой трубы от мышей или свиной6,,78,9,10,11. Изображений микроструктур стены обычно выполняется с помощью нелинейных оптических методов, воспользовавшись аутофлюоресценция эластина и второе поколение гармонических коллаген. Это позволяет пространственно-временных изображений двух основных компонентов внеклеточного матрикса, эластин и коллаген, без необходимости для окрашивания. Визуализации артериальной стенки в полной толщине является проблемой в больших каналом артерии из-за рассеяния света в средствах массовой информации толстые туника. Однако чтобы определить, как микроархитектура структурных компонентов артериальной стенки связаны наблюдаемое механических свойств, трехмерные информация должна быть получена в ходе механических испытаний. Для крупных артерий как человека аорты это требует биаксиальные оплетки монтажа, механические испытания и изображений регионов интерес в 1-2 см2 шт артериальной стенки7,9,10, 12. только часть стены могут быть образы и механически испытания.
Для мелких артерий любых видов (например, человеческий перикард13, легочной14 и подкожной15 артерий, крыса верхней брыжеечной артерии16,,1718, 19 , 20, cremaster мыши, брыжеечный, головного мозга, бедренных и сонных артерий21,22,23,24,25,26, 27) изображений всей толщины возможно и может сочетаться с механических испытаний. Это позволяет одновременной записи механических свойств и структурных договоренностей внутри стены. Однако прямой математическое моделирование взаимоотношений между наблюдаемыми изменениями в трехмерной структуры ECM и изменения механических свойств сопротивления артериальной стенки, в меру наших знаний только поступили после Недавно в человеческое сопротивление артерий13,15.
В этой работе описан метод ex vivo для пассивного механических испытаний и одновременное трехмерных изображений микроархитектуры эластина и коллагена в артериальной стенки артерий изолированных человеческое сопротивление. Визуализации протокол может применяться к артерии сопротивления любых видов, представляющих интерес. Анализ изображений описаны для получения мер внутреннего упругой пластинки ветвления углов и adventitial коллагена прямолинейность13 с помощью Фиджи28. Объем плотность коллагена и эластина, определяются с помощью программного обеспечения Ilastik29 , и наконец, обсуждается включение механических и визуализации данных в математических моделях артериальной стенки механики.
Цель описания изображений и изображения анализ методов в сочетании с математическое моделирование заключается в предоставлении следователи системный подход для описания и понять наблюдаемые изменения давления индуцированной в ECM сопротивления артерий. Описан метод ориентирован в количественную оценку изменений в ECM в судно во время наддув, сравнивая структуру ECM в 20, 40 и 100 мм рт.ст.. Эти факторы были выбраны для определения структуры артериальной стенки на его более совместимым (20 mmHg), жесткая (100 мм рт.ст.) и промежуточное состояние (40 mmHg), соответственно. Однако любой процесс в сосудистой стенке артерий живой, включая изменения, индуцированных вазоактивных компонентов, гистерезис и потока, может быть определена количественно, в зависимости от гипотезы исследования вопрос следователя.
Особое внимание уделяется использование микроскопии флуоресцирования возбуждения двух фотонов (TPEM) в сочетании с myograph давления для изучения давления (или других) индуцированного изменения в ECM живой артерий. Во-первых потому что это позволяет одновременное приобретение общей трехмерной структуры артериальной стенки (диаметр и толщина стенки) наряду с трехмерной метки бесплатно приобретение высокого качества, подробные изображения коллагена и эластина схемотехнические как описано13 , воспользовавшись аутофлюоресценция эластина и коллагена второй гармоники поколения сигнала (SHG)30. Во-вторых TPEM позволяет, что допускается использование ближней ИК-области спектра возбуждения низкой энергии света, минимизации повреждений ткани и таким образом, повторяющихся изображений на точно таком же положении в сосудистой стенке, позволяющей повторить измерения анализ наблюдается изменения.
Использование альтернативного подхода с использованием конфокальная томография давления фиксированной артерий обсуждается позволяет пользователям без доступа к TPEM возможность использовать метод описан как хорошо. Информация о плотности структуры и объема ECM можно получать также из двумерный анализ тканей секционного в последовательный порт, например, как описано на31,32. Однако, ввиду отсутствия возможности для получения трехмерных структурную информацию над шкалой длина артерии, а также в ходе изменения условий, с помощью этого метода, это не рекомендуется использовать этот подход для расследования давления и лечения индуцированных трехмерной изменения в ECM.
Минимальным требованием для детектива, чтобы применить метод здесь описано является доступ к установке для катетеризации и герметизация артерий в сочетании с микроскопом конфокальный или два Фотон возбуждения флуоресценции. Установки, описанные в следующий протокол является заказ давления myograph с продольной силы датчика, построен, чтобы поместиться на пользовательские построен Перевернутый двух Фотон возбуждения флуоресценции микроскопа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа представляет собой наше предложение стандартизированных, комбинированные изображений и давления миография подхода, ценные для одновременной оценки механических свойств сопротивления артерий и связанные с давлением изменения в структуре артериальной стены в диапазоне да…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят изображений центра молекулярной биомедицинских датского на факультет естественных наук, Университет Южной Дании, за использование лабораторий и микроскопы. Кристоффер Rosenstand и Мельхиор Ulla признаны за отличную техническую помощь с давлением миография и изображений.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
Referências
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
