ラベル無料蛍光顕微鏡によるライブ、人間の抵抗血管のコラーゲンとエラスチンの圧力依存性アーキテクチャを評価します。
Summary
同時に機械的テストを記述し、孤立の動脈壁の 3 D イメージング生きる人間の抵抗動脈とエラスチンとコラーゲンの組織およびボリュームの空間密度の定量化のためのフィジーと Ilastik の画像解析.動脈壁の力学の数理モデルでこれらのデータの利用について述べる。
Abstract
抵抗動脈リモデリングの病原性の貢献は、本態性高血圧、糖尿病、メタボリック シンドロームに記載されています。調査と健康と病気の人間の抵抗動脈の機械的性質を理解するための微視組織的動機の数理モデルの開発の理解を支援するために可能性がありますどのように病気と治療人間の微小循環に影響を与えます。これらの数学モデルを開発するには、血管壁の機械とマイクロ アーキテクチャの特性の関係を解読する不可欠です。この作品は、受動的な機械試験とエラスチンとコラーゲン分離人間の抵抗動脈の動脈壁の微細構造の同時ラベル無料三次元イメージングのex vivo法について述べる.画像のプロトコルは、関心の任意の種の抵抗血管に適用できます。画像解析は、i) 圧力誘起変化内弾性板分岐角度とフィジーと Ilastik ソフトウェアを使用して決定 ii) コラーゲンとエラスチンの量密度を使用して外コラーゲン真直度を定量化するため説明します。できればライブ、灌流動脈のすべての機械的およびイメージング測定が実行されます、ただし、再加圧反応槽のポスト固定イメージングの標準ビデオ顕微鏡圧力の組み合わせで図法を使用して代替方法はについて説明します。この代替方法は、解析手法のさまざまなオプションを持つユーザーを提供します。動脈壁の力学の数理モデルの機械的およびイメージングのデータを含めることが論議され、将来の開発と、プロトコルへの追加を提案しました。
Introduction
病原性の貢献と抵抗動脈改造の効果は、本態性高血圧、糖尿病、メタボリック シンドローム1,2,3,4,5に記載されています。血管壁の機械とマイクロ アーキテクチャの特性の関係を解読するこの協会の数学モデルを開発に不可欠です。このようなモデルは、改造プロセスの理解を向上させる、silico モデル ターゲット疾患動脈壁の改造薬理学的戦略をテストするために便利での開発をサポートします。
理解どのように力学対策を組み込むことにより動脈壁の力学に関連する動脈壁の微細構造、細胞外マトリックス (ECM) の微細構造が大規模に実施されるほとんど専ら焦点を当てた先行研究、マウスまたは豚6,7,8,9,,1011から弾性導管動脈。壁の微細構造のイメージングは、通常コラーゲン、エラスチンと第二高調波発生の蛍光の活用、非線形光学技術を使用して実行されます。これは、細胞外マトリックス、エラスチンやコラーゲン、汚損のための必要性なしの 2 つの主要なコンポーネントの時空間イメージングできます。完全な厚さの動脈壁のイメージングは、厚いチュニカ メディアにおける光の散乱による大規模な導管動脈に挑戦です。ただし、機械のテスト中に、どの動脈壁の構造コンポーネントのアーキテクチャ関連観測の機械的性質を決定する三次元情報を得なければなりません。二軸取付、機械検査と動脈壁7,9,10,の 1-2 cm2個セットの関心領域の画像診断が必要ですこのひと大動脈のような太い動脈の12. 壁の部分だけをイメージ、機械的にテストできます。
任意の種の小さい動脈の (例えば、 13人間心嚢、肺14皮下15動脈、ラット腸間膜動脈16,17,18,19,20マウス クレマスター、腸間膜、脳、大腿骨と頚動脈21,22,23,24,25,26,全体の肉厚の27) イメージング、機械試験と組み合わせることができます。これは機械的性質や壁内構造の手配の同時記録を可能します。ただし、直接数学的モデリングの ECM の立体構造の観察された変化と抵抗動脈壁の変更された機械的特性との関係だけに我々 の知識を最大限に報告されている時に最近では人間の抵抗動脈13,15。
この作品は、受動的な機械試験とエラスチンとコラーゲン分離人間の抵抗動脈の動脈壁の微細構造の同時 3次元イメージングのための前のヴィヴォメソッドを呼びます。画像のプロトコルは、関心の任意の種の抵抗血管に適用できます。画像解析は、内弾性板分岐角度の外コラーゲン真直度13フィジー28を使用してメジャーを取得する説明します。コラーゲンとエラスチンの量密度は、Ilastik ソフトウェア29を使用して決定され、動脈壁の力学の数理モデルの機械的およびイメージング データの包含を議論する最後に。
技術と数理モデルの組み合わせでは捜査官に説明や理解の体系的なアプローチを提供する画像処理と画像解析を記述するための目標は、抵抗血管の ECM の内圧の変化を観察しました。この方法は 20、40、100 mmHg に ECM の構造を比較することで加圧中に容器内の ECM の変化の定量に集中します。これらの圧力は、それぞれより多くの準拠 (20 mmHg)、堅い (100 mmHg) 中間 (40 mmHg) 状態で動脈壁の構造を決定するために選ばれました。ただし、血管作動性コンポーネント、ヒステリシス、流れ、変化を含むライブの動脈の血管壁の任意のプロセスは調査官によって研究仮説によって示すことができます。
ライブの動脈の ECM の勉強圧力 (またはその他) による変化第 1 報圧力との組み合わせにおける 2 光子励起蛍光顕微鏡 (TPEM) の使用を強調しました。まず、高品質の 3次元情報ラベル無料取得とともに動脈の壁 (径および壁厚) の全体的な 3次元構造の同時取得できる、ために詳細コラーゲンとエラスチンの画像説明13自発蛍光をエラスチンとコラーゲンの第二高調波発生 (SHG) 信号30を利用して見学。次に、TPEM により組織およびこうして、血管壁内で正確に同じ位置に繰り返し画像の光損傷を最小限に抑え、低エネルギー近赤外励起光の使用を許可すると、許可する繰り返し測定と解析の観察変更します。
動脈を固定圧力の共焦点イメージングを用いた代替アプローチの使用は、TPEM にアクセスすることがなく同様の記載されているメソッドを使用する機会をできるように説明します。ECM の構造とボリュームの密度については、例えば31,32で定義されているシリアルの断面組織の 2次元解析からも取得できます。ただし、だけでなく、このメソッドを使用して条件を変更する時に動脈の長さスケールで立体構造情報を取得する可能性の欠如、それは圧力の調査のためのこのアプローチを使用してはお勧めしませんし、治療は、ECM の三次元変化を誘発します。
ここに記述された方法を適用する治験責任医師の最低限の要件は、挿管および共焦点または 2 光子励起蛍光顕微鏡との組み合わせで動脈の加圧のセットアップへのアクセスです。次のプロトコルで説明されているセットアップは、カスタム構築された倒立 2 光子励起蛍光顕微鏡に合わせて建てられた縦力の変換器を用いた特注圧力第 1 報です。
Protocol
Representative Results
Discussion
この作業が標準化された、結合されたイメージングと圧力図法のアプローチ、抵抗血管や動脈の構造の変化を圧力関連の機械的性質の評価を同時に貴重な提案を表します0 ~ 100 mmHg の圧力範囲上の壁。動脈壁のイメージングは、両方の機器の設計するときは、第任意圧力の 1 報 2 光子励起蛍光顕微鏡に合ったが使用できますただし、提示されたアプローチは、カスタム内蔵機器を使用して開発…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、研究所、顕微鏡の使用のためデンマーク分子医用イメージング センター南デンマーク大学自然科学部をありがとうございます。クリストファー Rosenstand、ウラ メルヒオールは、図法・ イメージング圧力と優れたテクニカル サポートに認められています。
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
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