Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre
Summary
Descrevemos teste mecânico simultânea e imagens 3D de parede arterial isolada, viver artérias de resistência humana e análises de imagem de Fiji e Ilastik para a quantificação de elastina e colágeno espacial organização e volume densidades. Discutimos a utilização desses dados em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial.
Abstract
A contribuição de patogenicidade de resistência artéria remodelação está documentada em hipertensão essencial, diabetes e síndrome metabólica. Investigações e desenvolvimento de modelos matemáticos microstructurally motivados para compreender as propriedades mecânicas das artérias de resistência humana na saúde e na doença têm o potencial para auxiliar a compreensão como doenças e tratamentos médicos afetam a microcirculação humana. Para desenvolver estes modelos matemáticos, é essencial para decifrar a relação entre as propriedades mecânicas e microarquitetura de parede microvascular. Neste trabalho, descrevemos um método ex vivo para testes mecânicos passiva e simultânea de imagem tridimensional livre de rótulo de microarquitetura de elastina e colágeno na parede arterial das artérias de resistência humana isolada. O protocolo de imagem pode ser aplicado para as artérias de resistência de qualquer espécie de interesse. Análises de imagem são descritas para quantificar alterações i) pressão induzida em ângulos ramificação lâmina elástica interna e retidão de colágeno adventícia usando Fiji e densidades de volume ii) colágeno e elastina determinadas utilizando o software Ilastik. De preferência todas as medidas de mecânicas e de imagem são executadas em artérias perfundidas, ao vivo, no entanto, uma abordagem alternativa usando pressão standard de vídeo-microscopia miografia em combinação com pós-fixação imagem de vasos re-pressurizados discutido. Este método alternativo fornece aos usuários com diferentes opções de abordagens de análise. A inclusão dos dados mecânicos e da imagem latente em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial é discutida, e propõem-se desenvolvimento futuro e adições ao protocolo.
Introduction
A contribuição patogénica e efeitos de resistência artéria remodelação estão documentados na hipertensão essencial, diabetes e síndrome metabólica1,2,3,4,5. Decifrar a relação entre as propriedades mecânicas e microarquitetura de parede microvascular é essencial para o desenvolvimento de modelos matemáticos desta associação. Tais modelos irão melhorar a compreensão do processo de remodelação e apoiarão o desenvolvimento de modelos de silico útil para testar estratégias farmacológicas direcionamento doença relacionada a remodelação da parede arterial.
Estudos prévios focada na compreensão de como a microarquitetura da parede arterial refere-se à mecânica da parede arterial, incorporando medidas mecânicas e a microarquitetura da matriz extracelular (ECM) são executadas quase que exclusivamente em grandes , artérias elásticas conduíte de ratos ou suína6,7,8,9,10,11. Imagens das microestruturas de parede geralmente é executada usando técnicas de ópticas não-lineares, aproveitando a autofluorescência de elastina e segunda geração harmônica por colágeno. Isso permite que a imagem spatiotemporal dos dois principais componentes da matriz extracelular, elastina e colágeno, sem a necessidade de coloração. Imagem latente da parede arterial em toda a sua espessura é um desafio em artérias grandes conduit devido à dispersão da luz na mídia grossa túnica. No entanto, para determinar como a microarquitetura dos componentes estruturais da parede arterial se relacionam com as propriedades mecânicas observadas, a informação tridimensional deve ser obtida durante o teste mecânico. Para as grandes artérias como a aorta humana, isso requer montagem biaxial, testes mecânicos e imagem de regiões de interesse em pedaços de2 1-2 cm da parede arterial7,9,10, 12. apenas uma parte da parede pode ser fotografada e testada mecanicamente.
Para artérias menores de qualquer espécie (por exemplo, subcutâneo15 artérias, rato artérias mesentéricas16,17,18, , pulmonar14 e pericárdica humano13 19 , 20, rato cremaster, mesentérica, cerebral, femoral e artérias carótidas21,22,23,24,25,26, imagem de 27) da espessura da parede inteira é possível e pode ser combinada com o teste mecânico. Isto permite a gravação simultânea de propriedades mecânicas e os arranjos estruturais dentro da parede. No entanto, uma modelagem matemática direta da relação entre as alterações observadas na estrutura tridimensional da ECM e alterado as propriedades mecânicas da parede arterial de resistência, o melhor de nosso conhecimento apenas relatou em cima recentemente, na resistência humana artérias13,15.
Neste trabalho, é descrito um método ex vivo para testes mecânicos passiva e simultânea de imagem tridimensional de microarquitetura de elastina e colágeno na parede arterial das artérias de resistência humana isolada. O protocolo de imagem pode ser aplicado para as artérias de resistência de qualquer espécie de interesse. Análises de imagem são descritas para a obtenção de medidas de ângulos de ramificação de lâmina elástica interna e de retidão de colágeno adventícia13 usando Fiji28. Densidades de volume de colágeno e elastina são determinadas usando o software de Ilastik29 , e finalmente, a inclusão dos dados mecânicos e da imagem latente em modelos matemáticos da mecânica da parede arterial é discutida.
O objetivo de descrever as imagem e imagem análises técnicas em combinação com a modelagem matemática é proporcionar a investigadores uma abordagem sistemática para descrever e compreender observadas mudanças de pressão induzida em ECM das artérias de resistência. O método descrito é focado em quantificar as alterações em ECM em um navio durante a pressurização, comparando a estrutura de ECM em 20, 40 e 100 mmHg. Essas pressões foram escolhidas para determinar a estrutura da parede arterial em sua mais compatível (20 mmHg), stiff (100 mmHg) e estado intermediário (40 mmHg), respectivamente. No entanto, qualquer processo na parede vascular das artérias ao vivo, incluindo alterações induzidas por componentes vasoativas, histerese e fluxo, pode ser quantificado, dependendo a hipótese de investigação em questão pelo investigador.
O uso da microscopia de fluorescência de excitação de dois fotões (TPEM) em combinação com um myograph de pressão para mudanças de pressão (ou outro) induziu a estudar em ECM das artérias ao vivo é enfatizado. Primeiro, porque isso permite a aquisição simultânea da estrutura global tridimensional da parede arterial (espessura de diâmetro e parede), juntamente com a aquisição de etiqueta livre tridimensional de alta qualidade, detalhadas imagens de colágeno e elastina microarchitectures como descrito13 , aproveitando a autofluorescência de elastina e colágeno segunda geração harmônica sinal (SHG)30. Em segundo lugar, TPEM permite uso de luz de baixa energia infravermelha excitação, minimizando Fotodano do tecido e assim, imagens repetidas em exatamente na mesma posição dentro da parede vascular é permitido, permitindo análises de medições repetidas do observado alterações.
O uso de uma abordagem alternativa, usando a imagem latente confocal de pressão fixada artérias é discutido para permitir que usuários sem acesso ao TPEM a oportunidade de usar o método descrito também. Informações sobre densidades de ECM estrutura e volume também podem ser obtidas de análises bidimensionais de tecidos seccionados em série, por exemplo, como descrito por31,32. No entanto, devido à falta de possibilidade para recuperar informações estruturais tridimensionais sobre as escalas de comprimento da artéria, bem como durante a mudança de condições usando este método, é que não recomendo usar essa abordagem para investigações de pressão e tratamento induzido por alterações tridimensionais em ECM.
O requisito mínimo para o investigador aplicar o método descrito neste documento é o acesso a uma instalação para canulação e pressurização das artérias em combinação com um microscópio de fluorescência confocal ou dois fotões de excitação. A configuração descrita no seguinte protocolo é um myograph de pressão Custom-Built com um transdutor de força longitudinal, construído para caber em um microscópio de fluorescência personalizado construído invertido dois fotões da excitação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho representa a nossa sugestão para uma padronizada combinada imaging e pressão miografia abordagem, valiosa para a avaliação simultânea das propriedades mecânicas de resistência das artérias e alterações relacionadas à pressão na estrutura da arterial parede ao longo de uma faixa de pressão de 0 a 100 mmHg. A abordagem apresentada foi desenvolvida utilizando equipamento construído personalizado, no entanto, pode ser usado qualquer myograph de pressão que caiba em um microscópio de fluorescênc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer o dinamarquês Molecular Biomedical Imaging Center da faculdade de ciências naturais, Universidade do Sul da Dinamarca, o uso de laboratórios e microscópios. Kristoffer Rosenstand e Ulla Melchior são reconhecidos pela excelente assistência técnica, com a pressão miografia e da imagem latente.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
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