Évaluation de collagène et élastine Microarchitectures dépendant de la pression dans les artères de résistance vivants, humains en microscopie par Fluorescence Label-free
Summary
Nous décrivons simultanée des essais mécaniques et 3D-imagerie de la paroi artérielle d’isolé, vivent les artères de la résistance humaine et des analyses d’image Fidji et Ilastik pour la quantification des densités de volume et d’organisation spatiales élastine et de collagène. Nous discutons de l’utilisation de ces données dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.
Abstract
La contribution de pathogène de résistance artère remodelage est documentée dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique. Enquêtes et le développement de modèles mathématiques microstructurally motivés pour comprendre les propriétés mécaniques des artères de résistance humain sain ou malade ont le potentiel pour aider à comprendre comment la maladie et les traitements médicaux effet sur la microcirculation humaine. Pour développer ces modèles mathématiques, il est essentiel de déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire. Dans ce travail, nous décrivons une méthode ex vivo pour essais mécaniques passives et simultanée exempte d’étiquette imagerie en trois dimensions de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour quantifier les changements i) induit par la pression dans les angles de ramification de la limitante élastique interne et de la rectitude de collagène adventitiels à l’aide de Fidji et des densités de volume ii) collagène et d’élastine, déterminées à l’aide du logiciel Ilastik. Préférence toutes les mesures mécaniques et d’imagerie sont effectuées sur les routes de live, perfusés, cependant, est une approche alternative à l’aide de pression standard de vidéo-microscopie myographie en combinaison avec l’imagerie après fixation de re-pressurisés discutés. Cette méthode alternative offre aux utilisateurs des options différentes pour les approches de l’analyse. L’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle est discutée, et développement futur et ajouts au protocole sont proposées.
Introduction
La contribution pathogène et les effets du remodelage de l’artère de résistance sont documentées dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique1,2,3,4,5. Déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire est essentiel pour le développement de modèles mathématiques de cette association. Ces modèles seront mieux comprendre le processus de remodelage et soutiennent le développement de modèles de silico utile pour tester des stratégies pharmacologiques ciblant des maladies liées de remodelage de la paroi artérielle.
Études préalables porté à comprendre comment la microarchitecture de la paroi artérielle est liée à la mécanique de la paroi artérielle en incorporant des mesures mécaniques et la microarchitecture de la matrice extracellulaire (ECM) sont presque exclusivement réalisées sur les grands , les artères élastiques conduit des souris ou porcine6,7,8,9,10,11. Imagerie des microstructures de la paroi est généralement effectuée à l’aide des techniques optiques non linéaires, profitant de l’autofluorescence d’élastine et de deuxième génération harmonique de collagène. Cela permet l’imagerie spatio-temporelle des deux principales composantes de la matrice extracellulaire, élastine et du collagène, sans une nécessité pour la coloration. Imagerie de la paroi artérielle dans toute son épaisseur est un défi dans les artères de gros conduits en raison de la dispersion de la lumière dans les médias de tunica épais. Toutefois, pour déterminer comment la microarchitecture des composantes structurales de la paroi artérielle portent sur les propriétés mécaniques observées, informations en trois dimensions doivent être obtenues pendant l’essai mécanique. Pour les grosses artères comme l’aorte humaine, cette opération requiert biaxial montage, les essais mécaniques et imagerie des régions d’intérêt en morceaux2 1-2 cm de la paroi artérielle7,9,10, 12. qu’une partie de la paroi peut être imagée et testée mécaniquement.
Pour les plus petites artères de toute espèce (par exemple, péricardique humaine13, pulmonaire14 et les artères sous-cutanées15 , rat artères mésentériques16,17,18, 19 , 20, souris cremaster, mésentérique, cérébrale, fémorale et artères carotides21,22,23,24,25,26, 27) imagerie de l’épaisseur du mur entier est possible et peut être combinée avec les essais mécaniques. Cela permet l’enregistrement simultané des propriétés mécaniques et les arrangements structurels au sein de la paroi. Toutefois, une modélisation mathématique directe de la relation entre les altérations observées dans la structure tridimensionnelle de l’ECM et modifié les propriétés mécaniques de la paroi artérielle de résistance, au meilleur de nos connaissances seulement signale à récemment dans les artères de la résistance humaine13,15.
Dans ce travail, on décrit une méthode de ex vivo pour essais mécaniques passives et une imagerie tridimensionnelle simultanée de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour l’obtention de mesures des angles de ramification de la limitante élastique interne et de rectitude de collagène adventitiels13 à l’aide de Fidji28. Les densités de volume collagène et d’élastine sont déterminées au moyen de logiciels Ilastik29 et enfin, on discute de l’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.
Le but de décrire les analyses de l’imagerie et l’image en combinaison avec la modélisation mathématique des techniques consiste à fournir aux enquêteurs une approche systématique pour décrire et comprendre la pression induite par changements observés dans l’ECM des artères de résistance. La méthode décrite vise à quantifier les changements dans l’ECM dans un récipient pendant la pressurisation, en comparant la structure de l’ECM à 20, 40 et 100 mmHg. Ces pressions ont été retenues pour la détermination de la structure de la paroi artérielle plus dociles (20 mmHg), raide (100 mmHg) et un état intermédiaire de (40 mmHg), respectivement. Cependant, tout processus dans la paroi vasculaire des artères vivants, y compris les changements induits par les composants vasoactifs, hystérésis et flux, peut être quantifié, selon l’hypothèse de recherche en question par l’enquêteur.
L’utilisation de la microscopie de fluorescence excitation biphotonique (TPEM) en combinaison avec un myographe pression pour étudier la pression (ou autre) induit des changements dans l’ECM des artères direct est mis en valeur. Tout d’abord, parce que cela permet une acquisition simultanée de la structure tridimensionnelle dans l’ensemble de la paroi artérielle (diamètre et épaisseur de paroi) ainsi que l’acquisition de label-free tridimensionnelle de haute qualité, des images de la collagène et d’élastine détaillées microarchitectures comme décrit13 en profitant de l’autofluorescence élastine et le collagène deuxième génération harmonique signal (SHG)30. Deuxièmement, TPEM permet d’utilisation de la lumière d’excitation proche-infrarouge de faible énergie, minimiser le photovieillissement du tissu et ainsi, l’imagerie répété à exactement la même position dans la paroi vasculaire est autorisée, permettant des analyses répétées-Mensurations d’observé changements.
L’utilisation d’une approche alternative à l’aide de l’imagerie confocale de pression fixé des artères est discutée pour permettre aux utilisateurs sans accès à TPEM l’occasion d’utiliser la méthode décrite aussi bien. Informations sur la structure et le volume des densités ECM peuvent également être récupérées de l’analyse bidimensionnelle des tissus sectionnés en série, par exemple, tel que décrit par31,32. Toutefois, en raison de l’absence de possibilité de récupérer des informations structurelles en trois dimensions sur les échelles de longueur de l’artère ainsi qu’au cours de l’évolution des conditions à l’aide de cette méthode, il est déconseillé d’utiliser cette approche pour les enquêtes de pression et traitement induit des changements en trois dimensions de la MEC.
L’exigence minimale pour l’enquêteur d’appliquer la méthode décrite ci-après est l’accès à un programme d’installation pour canulation et la pressurisation des artères en combinaison avec un microscope à fluorescence excitation confocal ou deux photons. La configuration décrite dans le protocole suivant est un myographe pression sur mesure avec un capteur de force longitudinale, construit pour s’adapter sur un microscope à fluorescence personnalisé excitation construit à deux photons inversé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail représente notre suggestion pour un standard, combinée d’imagerie et de la pression myographie approche, précieuse pour l’évaluation simultanée des propriétés mécaniques des artères de résistance et les changements liés à la pression dans la structure de cette artère mur sur une plage de pression de 0 à 100 mmHg. L’approche présentée a été développé en utilisant des équipements de construction personnalisée, cependant, n’importe quel myographe de pression qui s’adapte sur un mic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le centre d’imagerie biomédicale danois moléculaire à la Faculté des Sciences naturelles, University of Southern Denmark, pour l’utilisation des laboratoires et des microscopes. Kristoffer Rosenstand et Ulla Melchior sont reconnues pour l’excellente assistance technique avec la pression myographie et d’imagerie.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
Referências
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
