أسلوب المستندة إلى الأشعة المقطعية الصغرى لتميز الآفات وتحديد مواقع الأقطاب في أدمغة الحيوانات الصغيرة
Summary
توضح هذه المقالة طريقة واضحة لإعداد أدمغة الحيوانات الصغيرة لتصوير الأشعة المقطعية الصغرى، في الآفات التي يمكن قياسها كمياً واقطاب الموقع بدقة عالية في سياق الدماغ كله.
Abstract
التحقق من مكان الآفة والقطب تتم تقليديا عبر نسيجية فحص شرائح المخ الملون، إجراء تستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب تقدير دليل. وهنا يصف لنا أسلوب بسيط ومباشر للتحديد الكمي للآفات وتحديد مواقع أقطاب كهربائية في الدماغ الذي هو أقل مشقة، وتعطي نتائج أكثر تفصيلاً. العقول كلها ملطخة بأكسيد الاوزميوم، جزءا لا يتجزأ من الراتنج، وتصويرها مع الماسح ضوئي CT الصغرى. المسح الضوئي ينتج وحدات التخزين الرقمي 3D للعقول مع القرارات وسمك الفرع الافتراضي يعتمد على حجم العينة (12-15 و 5-6 ميكرون كل فوكسل للفئران وحمار وحشي فينش العقول، على التوالي). الآفات السطحية والعميقة يمكن أن توصف، وواحدة تيتروديس, تيترودي صفائف, آفات كهربائياً، ويمكن أيضا أن تكون مترجمة المسابير السليكون. البرمجيات الحرة والملكية يسمح المجربون لدراسة حجم العينة من أي طائرة والجزء المتعلق بالحجم يدوياً أو تلقائياً. نظراً لأن هذا الأسلوب إنشاء حجم الدماغ كله، الآفات واقطاب يمكن قياسها كمياً لدرجة أعلى بكثير مما في الأساليب الحالية، مما سيساعد على توحيد المقارنات داخل وعبر الدراسات.
Introduction
علماء الأعصاب قد اعتمدت على الآفات لفترة طويلة من أجل فهم العلاقة بين الوظيفة والمكان في الدماغ. على سبيل المثال، قد فهمنا الحصين بأنه لا غنى عنه للتعلم والذاكرة وقشرة prefrontal كمفتاح للتحكم دفعة منتجات كلا من آفات الصدفة في البشر1،2. قد يسمح باستخدام نماذج حيوانية، ولكن علماء الأعصاب لتسخير القوة الآفات التي يتجاوز مجرد الصدفة، وقد تم توضيح الوظيفة من عدد لا يحصى من مناطق الدماغ من خلال دراسات منهجية للدالة هيكل العلاقات من خلال 3،الآفات4.
لتعيين الدالة بشكل صحيح إلى بنية، ومع ذلك، تتطلب دراسات الآفة إجراءات القياس الكمي الدقيق، وهي منطقة التي كانت تفتقر إلى. معيار الذهب الحالي للتحديد الكمي للآفات إلى الباب، وجبل، والعقول الصورة مع مجهر ضوء. ثم تتم مطابقة الشرائح المصورة لأقرب الفروع المتعلقة بأطلس، واحداثيات تقريبية للآفات عبر مواضيع غير مباشر يقال، غالباً من خلال استخدام الصور lucida الكاميرا أو المثال شرائح نسيجية3،4 ،،من56،،من78،9،10.
أبعد من عدم الدقة في الإجراءات الحالية لتقدير حجم الآفة، هذه التقنيات مضيعة للوقت وعرضه للفشل. يمكن أن تؤدي التغييرات الصغيرة في تصلب الدماغ والحدة بليد، ودرجة الحرارة إلى مقاطع فاشلة أو مشوه أو ممزقة. مقاطع يمكن أيضا وصمة عار غير متكافئ وتصويرها غير سليمة بسبب فقاعات في الأجلين المتوسط وتصاعد. الأهم من ذلك، تقطيع، إطار ثلاثي الأبعاد للموقع للآفة في الدماغ عند المفقودة، مما يجعل إعادة الإعمار 3D دقيقة من الآفة في تحدي الدماغ.
وقد آخر التطبيقات الشائعة للآفات لتحديد موقع واحد ومتعددة التسجيلات الكهربائي في الدماغ. في نهاية الدورة التسجيل النهائي، الباحثون حمل آفات الالكتروليتى صغيرة على طرف القطب وعملية المخ الأشيع كما فعلت في تجربة آفة تقليدية11. هذا الأسلوب يعاني من نفس العيوب المذكورة أعلاه، مع مشاكل إضافية هي أن تكون عادة أكبر من أقطاب كهربائية تستخدم لجعلها الآفات الالكتروليتى ولكن عادة ما تكون صغيرة بما يكفي بأنها تمثل تحديا لإيجاد الأشيع. عندما يتم إدراج متعددة الأقطاب، على غرار مجموعة تيترودي، التحقق من خلال الآفات الالكتروليتى حتى أكثر صعوبة. بديل لآفات الالكتروليتى هو استخدام صبغة على مسرى بعد التحقق من الأشيع12، ولكن هذا الأسلوب يعاني من نفس العيوب التي تأتي مع الأنسجة التقليدية.
هنا، يمكننا وصف متعمق أسلوب وصف مؤخرا13 استناداً إلى تلطيخ تقنيات الميكروسكوب الإلكتروني (م) والأشعة السينية المقطعي (الصغرى-CT) التي يوضحها الآفات ويحدد موقع الأقطاب في أدمغة الحيوانات الصغيرة أفضل من الحالية أساليب. CT الجزئي هو أسلوب تصوير فيها إطلاق النار الأشعة السينية في نموذج الذي يتم استدارة 360 درجة بينما يقوم سسينتيلاتور تجميع الأشعة السينية لا نحيد بالعينة. والنتيجة هي إعادة إعمار 3D رقمية ذات الدقة عالية للعينة التي يمكن أن تصور في أي اتجاه وتحديداً كمياً. وقد العديد من المؤسسات الأكاديمية الصغرى-CT الماسحات الضوئية، وهي أيضا متاحة تجارياً.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفيما يلي الخطوات الأساسية للبروتوكول: أولاً، استخدام مزيج من منهاج عمل بيجين والجأ نتخلل الحيوان وفي وقت لاحق بعد إصلاح الدماغ أمر بالغ الأهمية لتحقيق اختراق أوزميوم كاملة متسقة من الأنسجة. على الرغم من أننا لا اختبار هذا صراحة، تفسيراً معقولاً هو أن تثبيت PFA15من عكسها، حين أ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون لين جريج وآرثر ماكليلاند لخبرتهم مع آلة الأشعة المقطعية الصغرى وديفيد ريتشموند واليوت هنتر في الصورة وتحليل البيانات الأساسية (إيداك) في مدرسة هارفارد الطبية لهذه المشورة ومعالجة الصور، ووليام ليبرتي في بوسطن الجامعة تكرم توفير المخ زيبرا فينش. هذا العمل قد أنجز جزئيا في المركز لأنظمة النانو (CNS)، عضوا للوطنية تكنولوجيا النانو منسقة البنية التحتية الشبكة (ننسى)، الذي تدعمه “المؤسسة الوطنية للعلوم” NSF جائزة 1541959 رقم. الجهاز العصبي المركزي جزء من جامعة هارفارد. كان يؤيد هذا العمل ريتشارد و “سوزان سميث مؤسسة الأسرة” وإياربا (عقد #D16PC00002). وأيده S.B.E.W. زمالات دراسية من “برنامج العلوم البشرية الحدودية” (هفسب؛ LT000514/2014) والمنظمة الأوروبية في مجال البيولوجيا الجزيئية (التطريز؛ ALTF1561-2013). وأيد غ. غ. بمؤسسة العلوم الوطنية (NSF) الدراسات العليا البحوث زمالة برنامج (جرفب).
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
