Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen
Summary
Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.
Abstract
Laesie en elektrode locatie verificatie zijn traditioneel gedaan via histopathologisch onderzoek van gebeitst hersenen segmenten, een tijdrovende procedure waarvoor handmatige schatting. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de kwantificering van de laesies en lokaliseren van elektroden in de hersenen die is minder moeizaam en meer gedetailleerde resultaten oplevert. Hele hersenen zijn gekleurd met osmium tetroxide, ingebed in hars en beeld met een micro-CT-scanner. De scans resulteren in 3D digitale delen van de hersenen met resoluties en virtuele sectie diktes afhankelijk van de grootte van de steekproef (12-15 en 5-6 µm per voxel voor rat en Zebravink hersenen, respectievelijk). Dagbouw of diepe letsels kunnen gekarakteriseerd worden, en enkele schutterijofficieren, tetrode arrays, elektrolytische laesies en silicium sondes kunnen ook worden gelokaliseerd. Vrije en propriëtaire software kan onderzoekers te onderzoeken het monstervolume van een vliegtuig en segment het volume handmatig of automatisch. Omdat deze methode hele hersenvolume genereert, kunnen laesies en elektroden worden gekwantificeerd om een veel hogere mate dan in de huidige methoden, die zal helpen bij het standaardiseren van vergelijkingen binnen en tussen studies.
Introduction
Neurowetenschappers hebben vertrouwd op laesies voor een lange tijd om te begrijpen van de relatie tussen functie en locatie in de hersenen. Bijvoorbeeld, waren ons begrip van de hippocampus als onmisbaar voor leren en geheugen en van de prefrontale cortex als sleutel voor impuls controle beide producten van serendipitous laesies in mensen1,2. Het gebruik van diermodellen, echter neurowetenschappers om de kracht van letsels door verder te gaan dan serendipity heeft toegestaan, en de functie van talloze hersengebieden heeft zijn toegelicht door middel van systematische studies van de structuur-functie relaties door middel van laesies3,4.
Correct toewijzen functie naar een structuur, echter laesie studies precieze kwantificering procedures, die is een gebied dat heeft ontbroken. De huidige gouden standaard voor het kwantificeren van de laesies is sectie, mount en afbeelding hersenen met een lichte Microscoop. De verbeelde segmenten worden vervolgens vergeleken de dichtstbijzijnde secties op een atlas en de geschatte coördinaten van de laesies over onderwerpen worden niet indirect gerapporteerd, vaak door het gebruik van de camera lucida afbeeldingen of voorbeeld histologische segmenten3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Deze technieken zijn buiten de onnauwkeurigheid van de huidige laesie kwantificering procedures, tijdrovend en gevoelig voor storing. Kleine veranderingen in de hersenen stijfheid, blade scherpte en temperatuur kan leiden tot mislukte, kromgetrokken of gescheurde secties. Secties kunnen ook ongelijk vlek en worden onjuist beeld vanwege de bubbels in het medium van de montage. Nog belangrijker is, is de driedimensionale context van de laesie in de locatie in de hersenen op afdelen, verloren, waardoor nauwkeurige 3D-reconstructie van de laesie in de hersenen uitdagend.
Een andere gemeenschappelijke toepassing voor laesies is geweest om de locatie van de single en meerdere opnamen van de elektrode in de hersenen. Aan het einde van de laatste opname-sessie, onderzoekers veroorzaken kleine elektrolytische laesies op het puntje van de elektrode en histologisch zoals gedaan in een conventionele lesion experiment11de hersenen verwerken. Deze techniek lijden onder de dezelfde nadelen hierboven beschreven, met bijkomende problemen is dat de elektrolytische laesies zijn meestal groter dan de elektroden gebruikt om ze te maken, maar meestal klein genoeg zijn dat ze zijn uitdagend vinden histologisch. Wanneer meerdere elektroden worden ingevoegd, zoals in het geval van een matrix van tetrode, is keuring door middel van elektrolytisch laesies zelfs moeilijker. Een alternatief voor elektrolytische laesies is het gebruik van een kleurstof op de elektrode later controleren histologisch12, maar deze techniek lijdt de dezelfde nadelen die met conventionele histologie komen.
Hier beschrijven we diepgaande een recent beschreven methode13 gebaseerd op kleuring technieken in elektronenmicroscopie (EM) en X-ray berekend tomografie (micro-CT) kwantificeert laesies en lokaliseert elektroden in kleine dierlijke hersenen beter dan huidige methoden. Micro-CT is een beeldvormende techniek waarin x-stralen zijn schot op een monster dat is 360° gedraaid, terwijl een scintillator de x-stralen niet afgebogen door het monster verzamelt. Het resultaat is een hoge resolutie digitale 3D reconstructie van het monster die kan worden gevisualiseerd in elke oriëntatie en gekwantificeerd juist. Veel onderwijsinstellingen hebben micro-CT-scanners, die ook commercieel beschikbaar zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
De volgende kritische stappen bij het protocol zijn: ten eerste, het gebruik van een combinatie van PFA en GA naar de perfuse van het dier en vervolgens na het monteren van de hersenen was primordiaal voor het bereiken van overeenstemming volledige osmium penetratie van het weefsel. Hoewel wij dit niet expliciet testen, is een plausibele verklaring dat PFA fixatie omkeerbare15, overwegende dat GA fixatie niet omkeerbaar16,17 is. Omdat een …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Greg Lin en Arthur McClelland voor hun expertise met de micro-CT machine, David Richmond Hunter Elliott ter naar de spiegelbeeld en Data analyse Core (IDAC) aan de Harvard Medical School voor hun advies voor beeldverwerking en William Liberti in Boston Universiteit genadig voorzien van een Zebravink hersenen. Dit werk werd uitgevoerd onder in het midden voor nanoschaal systemen (CNS), een lid van de nationale nanotechnologie gecoördineerde infrastructuur netwerk (NNCI), die wordt ondersteund door de National Science Foundation onder NSF award nr. 1541959. CNS is een onderdeel van de Harvard-universiteit. Dit werk werd gesteund door de Richard en Susan Smith Family Foundation en IARPA (contract #D16PC00002). S.B.E.W. werd gesteund door beurzen van het Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) en de organisatie van de European Molecular Biology (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP).
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
