Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit
Summary
Cet article décrit une méthode simple pour préparer des petits cerveaux animaux pour l’imagerie micro-CT, dont les lésions peuvent être quantifiées et électrodes situés avec une grande précision dans le cadre de tout le cerveau.
Abstract
Lésion et électrode de vérification d’emplacement sont traditionnellement fait par l’examen histologique des tranches de cerveau tachées, une procédure longue nécessitant manuelle estimation. Nous décrivons ici une méthode simple et directe pour quantifier les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau qui est moins laborieux et donne des résultats plus détaillés. Cerveau entier est colorées au tétroxyde d’osmium, incorporé en résine et photographié avec un micro-tomodensitomètre. Les scans entraînent des volumes 3D numériques des cerveaux avec des résolutions et des épaisseurs de section virtuel dépendantes de la taille de l’échantillon (12 – 15 et 5 – 6 µm par voxel pour rat et zebra finch brains, respectivement). Les lésions superficielles et profondes peuvent être caractérisées et seul tétrodes, baies de tétrode, lésions électrolytiques, et silicium sondes peuvent également être localisées. Logiciels libres et propriétaires permet aux expérimentateurs d’examiner le volume de l’échantillon de n’importe quel avion et segment le volume manuellement ou automatiquement. Parce que cette méthode génère le volume du cerveau, des lésions et des électrodes peuvent être quantifiées à une beaucoup plus grande que les méthodes actuelles, qui aidera à normaliser les comparaisons au sein et entre les études.
Introduction
Les neuroscientifiques ont compté sur les lésions pendant une longue période afin de comprendre la relation entre la fonction et l’emplacement dans le cerveau. Par exemple, notre compréhension de l’hippocampe comme étant indispensable pour l’apprentissage et la mémoire et du cortex préfrontal comme étant la clé pour le contrôle des impulsions était les deux produits de lésions fortuites dans les humains1,2. L’utilisation de modèles animaux, cependant, a permis des neuroscientifiques d’exploiter la puissance des lésions en allant au-delà des serendipity, et la fonction de nombreuses zones du cerveau a été élucidée par le biais des études systématiques des relations structure-fonction à travers lésions3,4.
Pour affecter correctement fonction vers une structure, cependant, les études de lésion exigent des procédures de quantification précise, qui est une région qui a fait défaut. L’étalon-or pour quantifier les lésions actuel est de section, Mont et cerveaux d’image avec un microscope optique. Les tranches imagés sont ensuite mis en correspondance avec les sections plus proche de vous sur un atlas, et les coordonnées approximatives des lésions dans l’ensemble des sujets sont rapportées indirectement, souvent grâce à l’utilisation des images de caméra lucida ou exemple histologique tranches3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Au-delà de l’imprécision des procédures de quantification des lésions actuelles, ces techniques sont fastidieuses et sujettes à l’échec. Petits changements dans la rigidité du cerveau, netteté de la lame et la température peut conduire aux sections bâclées, déformées ou déchirées. Les sections peuvent tacher aussi inégalement et être mal photographiées à cause des bulles d’air dans le milieu de montage. Ce qui est important, à la découpe, le contexte en trois dimensions de l’emplacement de la lésion dans le cerveau est perdu, faire une reconstruction 3D précise de la lésion dans le cerveau des difficiles.
Une autre application courante pour des lésions a été de déterminer l’emplacement des simples et multiples enregistrements d’électrodes dans le cerveau. À la fin de la séance d’enregistrement final, chercheurs provoquent des petites lésions électrolytiques à l’extrémité de l’électrode et processus du cerveau histologiquement comme fait dans une expérience de lésion classique11. Cette technique souffre les mêmes inconvénients décrits ci-dessus, avec des problèmes supplémentaires étant que les lésions électrolytiques sont généralement plus grandes que les électrodes utilisées pour les rendre, mais sont généralement assez petites qu’ils sont difficiles à trouver sur le plan histologique. Lorsque plusieurs électrodes sont insérés, comme dans le cas d’un tableau de la tétrode, vérification par le biais de lésions électrolytiques est encore plus difficile. Une alternative aux lésions électrolytiques est l’utilisation d’un colorant sur l’électrode pour plus tard vérifier histologiquement12, mais cette technique souffre des mêmes inconvénients qui viennent avec l’histologie conventionnelle.
Nous décrivons ici approfondie une méthode décrite récemment13 basé sur la coloration des techniques de microscopie électronique (me) et la radiographie tomodensitométrie (micro-CT) qui quantifie les lésions et localise les électrodes dans le cerveau animal petit mieux que courant Méthodes. Micro-CT est une technique d’imagerie dans lequel les rayons x est tournés en un échantillon qui est orientable à 360° pendant qu’un scintillateur recueille les rayons x n’a ne pas déviés de l’échantillon. Il en résulte une reconstruction 3D numérique à haute résolution de l’échantillon qui peut être visualisée dans n’importe quelle orientation et quantifié précisément. De nombreux établissements universitaires ont micro-tomodensitomètres, qui sont également disponibles dans le commerce.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voici les étapes critiques du protocole : tout d’abord, l’utilisation d’une combinaison de PFA et GA perfuse l’animal et ensuite fixer le cerveau a été primordiale à la réalisation de pénétration d’osmium pleinement cohérente du tissu. Bien que nous n’ai pas tester cela explicitement, une explication plausible est que la fixation de la PFA est réversible15, alors que la fixation GA n’est pas réversible16,17. Parce …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Greg Lin et Arthur McClelland pour leur expertise avec la machine micro-CT, David Richmond et Hunter Elliott à l’Image et analyse de données Core (IDAC) à la Harvard Medical School pour leur conseils de traitement d’image et William Liberti à Boston Université de fournir gracieusement un cerveau zebra finch. Ce travail a été réalisé en partie au Centre pour le systèmes nanométriques (CNS), un membre de la National Nanotechnology coordonnée Infrastructure réseau (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation sous award NSF n ° 1541959. CNS est une partie de l’Université Harvard. Ce travail a été soutenu par Richard et Susan Smith Family Foundation et IARPA (contrat #D16PC00002). S.B.E.W. a été soutenu par les bourses de l’Human Frontier Science Program (HFSP ; LT000514/2014) et l’European Molecular Biology Organization (EMBO ; ALTF1561-2013). G.G. a été soutenue par la National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship programme (GRFP).
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
