Метод, основанный на микро CT, характеризующие поражений и расположения электродов в небольших животных мозги
Summary
Эта статья описывает простой метод для подготовки мелких животных мозги микро-КТ, в котором поражения могут быть количественно и электродов, расположенных с высокой точностью в контексте всего мозга.
Abstract
Поражения и электродом расположение проверки являются традиционно делается через гистологическом окрашенных мозга срезов, длительная процедура, которая требует ручной оценки. Здесь мы опишем простой, простой метод количественной оценки поражения и размещения электродов в мозг, который является менее трудоемким и более подробные результаты. Весь мозг окрашенных с осмия тетраоксид, встроенные в смоле и образ с микро КТ-сканера. Сканирует привести объемов 3D цифровой мозг с резолюциями и толщины виртуального раздела зависит от размера выборки (12 – 15 и 5 – 6 мкм за voxel для крыс и зебры Финч мозги, соответственно). Поверхностные и глубокие поражения можно охарактеризовать и одна tetrodes, тетрод массивы, электролитическое поражений, и кремния зонды также могут быть локализованы. Свободные и несвободные программное обеспечение позволяет экспериментаторов для изучения объем образца от любой плоскости и сегмент громкость вручную или автоматически. Потому что этот метод создает объем всего мозга, поражений и электроды могут быть количественно гораздо более высокой степени, чем в нынешних методов, который поможет стандартизировать сопоставлений в рамках исследования и.
Introduction
Неврологи полагались на поражения долгое время для того, чтобы понять связь между функцией и местоположение в головном мозге. Например наше понимание гиппокамп как необходимым для обучения и памяти и префронтальной коры как ключ для импульсного управления были оба продукта счастливое поражения людей1,2. Использование животных моделей, однако, позволило неврологи использовать всю мощь поражений, выходя за рамки serendipity, и функция бесчисленных областях мозга были выяснены путем систематического исследования структуры функция отношений через поражения3,4.
Однако, чтобы правильно назначить функцию к структуре, поражения исследования требуют точную количественную оценку процедур, что является областью, которая отсутствует. Текущий золотой стандарт для количественной оценки поражения является Секция, горе и изображения мозги с световой микроскоп. Фотосъемка кусочки затем сопоставляются в ближайший разделы на Атлас, и приблизительные координаты поражения по предметам косвенно сообщается, часто с помощью камеры lucida изображения или пример Гистологические срезы3,4 ,5,6,,78,9,10.
За пределами неточностей текущей поражения количественной оценки процедур эти методы являются длительным и склонны к провалу. Небольшие изменения в мозг жесткость, лезвие резкость и температуры может привести к неудачной, деформированные или порванные секций. Разделы также может испачкать неравномерно и быть неправильно imaged вследствие пузыри в средне-и монтажа. Важно отметить, что при резании, трехмерный контекст место поражения головного мозга теряется, делать точные 3D-реконструкции поражения в мозге трудные.
Другое общее приложение для поражения был для определения местоположения одного и нескольких записей электрода в головном мозге. В конце сессии окончательного звукозаписи исследователи побудить малые электролитический поражения на электрода и гистологически, как это сделано в обычных поражения эксперимент11процесса мозга. Эта техника страдает от же недостатки, описанные выше, с дополнительными проблемами, что электролитические поражений обычно больше, чем электроды, используемый для сделать их, но обычно достаточно малы, что они бросают вызов, чтобы найти гистологически. При вставке нескольких электродов, как и в случае массива тетрод, проверка через электролитический поражения является еще более сложной. Альтернативой электролитический поражения является использование красителя на электроде позже проверить гистологически12, но эта техника страдает от же недостатки, которые приходят с обычными гистологии.
Здесь мы описываем углубленного недавно описан метод13 , основанный на пятная методы электронной микроскопии (ЭМ) и рентгеновского компьютерная томография (микро CT), который дает количественную оценку повреждений и находит электродов в небольших животных мозги лучше, чем текущий методы. Микро-CT является Тепловизионная техника в котором рентген снимаются на образец, который поворачивается на 360° в то время как сцинтиллятора собирает рентген не отклоняются в образце. Результатом является высоким разрешением цифровой 3D-реконструкции образца, могут быть визуализированы в любой ориентации и количественно точно. Многие академические институты имеют микро КТ-сканеры, которые также доступны коммерчески.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ниже приводятся важнейшие шаги к протоколу: во-первых, использование сочетания PFA и GA perfuse животное и впоследствии пост исправить мозг имеет первостепенное значение для достижения последовательного полного осмий проникновения ткани. Хотя мы не проверить это явно, правдоподобное объяс?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Грег Лин и Артур Макклеланд за их опыт с микро КТ машина, Дэвид Ричмонд и Эллиотт охотник на изображение и данных анализа Core (IDAC) при Гарвардской медицинской школе для их обработки советы изображений и Уильям Liberti в Бостон Университет за любезное предоставление зебры Финч мозга. Эта работа была выполнена частично в центре для наноразмерных систем (ЦНС), членом из национального нанотехнологии скоординированной инфраструктуры сети (NNCI), который поддерживается Национальный научный фонд под NSF премии № 1541959. CNS является частью Гарвардского университета. Эта работа была поддержана Ричард и Фонда семьи Сьюзан Смит и IARPA (Договор #D16PC00002). S.B.E.W. была поддержана стипендии от человека пограничной науки программы (HFSP; LT000514/2014) и организация европейских молекулярной биологии (EMBO; ALTF1561-2013). Г.г. была поддержана, программа стипендий аспирантов исследований (GRFP) Национальный фонд науки (NSF).
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
