Ein Mikro-CT-basierte Verfahren zur Charakterisierung von Läsionen und Lokalisierung von Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode zur Vorbereitung von kleinen tierischen Gehirne für Mikro-CT-Bildgebung, in welche Läsionen quantifiziert werden können und Elektroden mit hoher Präzision im Kontext des gesamten Gehirns gelegen.
Abstract
Verifizierung der Läsion und Elektrode Lage erfolgt traditionell über histologische Untersuchung von gefärbten Gehirnscheiben ein zeitaufwändiges Verfahren, die manuelle Schätzung erfordert. Hier beschreiben wir eine einfache, unkomplizierte Methode zur Quantifizierung der Läsionen und Auffinden von Elektroden in das Gehirn, das ist weniger mühsam und liefert genauere Ergebnisse. Ganze Köpfe sind mit Osmium ausgefällt befleckt, in Harz eingebettet und abgebildet mit einem Mikro-CT-Scanner. Die Scans führen in 3D digital Bänden der Gehirne mit Auflösungen und virtuellen Bereich stärken abhängig von Größe der Stichprobe (12 – 15 und 5 – 6 µm pro Voxel für Ratte und Zebrafinken Gehirne, beziehungsweise). Oberflächlichen und tiefe Läsionen können charakterisiert werden und einzelne Tetroden, Tuberkuloseinfektion Arrays, elektrolytische Läsionen und Silizium-Sonden können auch lokalisiert werden. Freie und proprietäre Software kann Experimentatoren, das Probenvolumen von Flugzeug und Segment die Lautstärke manuell oder automatisch zu prüfen. Da diese Methode ganze Hirnvolumen generiert, können Läsionen und Elektroden in viel höherem Maße als in gängigen Methoden quantifiziert werden die helfen Vergleiche innerhalb und zwischen den Studien zu standardisieren.
Introduction
Neurowissenschaftler haben auf Läsionen für eine lange Zeit verlassen, um die Beziehung zwischen Funktion und Position im Gehirn zu verstehen. Zum Beispiel wurden unser Verständnis des Hippocampus als unerlässlich für lernen und Gedächtnis und des präfrontalen Kortex als Schlüssel zur Impulskontrolle beide Produkte von glücklichen Zufälle Läsionen im Menschen1,2. Die Verwendung von Tiermodellen, jedoch konnten Neurowissenschaftler um die Macht der Läsionen durch hinauszugehen, Serendipity, und hat die Funktion der unzähligen Hirnareale durch systematische Untersuchungen der Struktur-Funktions-Beziehungen durch aufgeklärt Läsionen3,4.
Um richtig Funktion einer Struktur zuzuordnen, jedoch erfordern Läsion Studien präzise Quantifizierung Verfahren, die eine Fläche, die gefehlt hat. Der aktuelle Goldstandard zur Quantifizierung der Läsionen ist Abschnitt, Berg und Bild Gehirne mit einem Lichtmikroskop. Die abgebildeten Scheiben sind dann in den nächsten Abschnitten auf einer Atlas abgestimmt, und die ungefähren Koordinaten der Läsionen über Themen werden indirekt gemeldet, oft durch den Einsatz von Kamera Lucida Bilder oder Beispiel histologischen Scheiben3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Über die Ungenauigkeit der derzeitigen Läsion Quantifizierung Verfahren sind diese Verfahren zeitaufwändig und fehleranfällig. Kleine Veränderungen im Gehirn Steifigkeit, Klinge Schärfe und Temperatur kann zu verpfuschten, verzogene oder zerrissene Abschnitte führen. Abschnitte können auch ungleichmäßig beflecken und unsachgemäß wegen Luftblasen in das Eindeckmittel abgebildet werden. Wichtig ist, ist beim Schneiden, dreidimensionalen Rahmen der Ort der Läsion im Gehirn verloren, präzise 3D-Rekonstruktion der Läsion im Gehirn schwierig machen.
Eine weitere häufige Anwendung für Läsionen wurde zur Bestimmung der Position von Einzel- und mehrere Aufnahmen der Elektrode im Gehirn. Am Ende der letzten Aufnahmesession Forscher induzieren kleine elektrolytische Läsionen an der Elektrodenspitze und verarbeitet das Gehirn histologisch wie in einem konventionellen Läsion Experiment11getan. Diese Technik leidet die gleichen Nachteile, die oben beschrieben, mit zusätzlichen Problemen ist, dass die elektrolytischen Läsionen meist größer als die Elektroden verwendet sind, um sie zu machen, aber sind in der Regel klein genug, die sie herausfordern, um histologisch zu finden. Wenn mehrere Elektroden, wie im Fall von einer Tuberkuloseinfektion Array eingesetzt werden ist eine Verifizierung durch elektrolytische Läsionen noch schwieriger. Eine Alternative zur elektrolytischen Läsionen ist die Verwendung eines Farbstoffes auf der Elektrode später histologisch12überprüfen, aber diese Technik leidet die gleichen Nachteile, die mit konventionellen Histologie kommen.
Hier beschreiben wir eingehende einer kürzlich beschriebenen Methode13 basierend auf Färbetechniken in Elektronenmikroskopie (EM) und Röntgen-Computertomographie (Mikro-CT), die quantifiziert Läsionen und sucht Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen besser als Strom Methoden. Mikro-CT ist ein bildgebendes Verfahren, in dem Röntgenstrahlen an einer Probe geschossen werden, die 360 ° gedreht wird, während ein Szintillator die Röntgenstrahlen nicht abgelenkt durch die Probe sammelt. Das Ergebnis ist eine hochauflösende digitale 3D-Rekonstruktion der Probe, die visualisiert in beliebiger Orientierung und präzise quantifiziert werden kann. Viele Hochschulen haben Mikro-CT-Scannern, die auch im Handel erhältlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Folgende sind wichtige Schritte für das Protokoll: Erstens die Verwendung einer Kombination aus PFA und GA Durchspülen des Tieres und anschließend nach dem Beheben des Gehirns war ausschlaggebend für die konsequente voll Osmium Durchdringung des Gewebes zu erreichen. Obwohl wir dies nicht explizit testen, ist eine plausible Erklärung, dass PFA Fixierung reversible15, GA-Fixierung ist nicht reversibel16,17. Da eine zweiwöchige Inkubat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Greg Lin und Arthur McClelland für ihr Fachwissen mit der Mikro-CT-Maschine, David Richmond und Hunter Elliott auf das Bild und Daten-Analyse-Kern (sein) an der Harvard Medical School für ihre Bildverarbeitungs-Beratung und William Liberti bei Boston Universität für die Bereitstellung von gnädig einer Zebrafinken-Gehirns. Diese Arbeit wurde teilweise in der Mitte für Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied von der nationalen Nanotechnologie abgestimmte Infrastruktur Netzwerk (NNCI), durchgeführt, die von der National Science Foundation unter NSF Award Nr. 1541959 unterstützt wird. CNS ist ein Teil von der Harvard University. Diese Arbeit wurde von Richard und Susan Smith Family Foundation und IARPA (Vertrag #D16PC00002) unterstützt. S.B.E.W. wurde unterstützt durch Stipendien aus dem Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) und der European Molecular Biology Organization (EMBO; ALTF1561-2013). G.g. wurde von der National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Programm (GRFP) unterstützt.
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
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