이 문서에서는 마이크로-CT 영상, 어떤 병 변 양이 정해질 수 있다와 전극 전체 뇌의 맥락에서 높은 정밀도와 위치에 대 한 작은 동물 두뇌를 준비 하는 간단한 방법을 설명 합니다.
병 변 및 전극 위치 확인은 전통적으로 통해 조직학 검사 스테인드 뇌 조각의 수동 추정을 요구 하는 시간이 걸리는 절차 다. 여기, 우리는 장애를 측정 하 고 덜 힘 드는 이며 더 자세한 결과 뇌의 전극 위치에 대 한 간단 하 고, 간단한 방법을 설명 합니다. 전체 두뇌 오스뮴 tetroxide 물, 수 지에 포함 되며 마이크로 CT 스캐너로 촬영. 검사 결과 해상도와 가상 섹션 두께 샘플 크기에 따라 두뇌의 3D 디지털 볼륨 (쥐와 얼룩말 피리 새 류 대 한 복 당 12-15와 5-6 µ m 머리, 각각). 표면과 깊은 병 변 특징 하실 수 있습니다 및 단일 tetrodes, tetrode 배열, 전해질 장애, 그리고 실리콘 프로브도 지역화할 수 있습니다. 무료 및 독점 소프트웨어는 수동 또는 자동으로 모든 비행기와 세그먼트 볼륨에서 샘플 볼륨을 검사 하는 경험이 있습니다. 이 방법은 뇌 볼륨을 생성 하기 때문에 병 변 및 전극 비교 시간과 연구에 걸쳐 표준화 하는 데 도움이 됩니다 현재 방법에 보다 훨씬 더 높은 학위를 측정할 수 수 있습니다.
신경 기능 및 뇌의 위치 사이의 관계를 이해 하기 위해서는 오랜 시간에 대 한 장애에 의존 했습니다. 예를 들어 우리의 이해 학습 및 메모리 불가결 되 고 마 키 충 동 제어에 대 한 것으로 전 두 엽 피 질 인간1,2serendipitous 변의 두 제품을 했다. 그러나 동물 모델,,를 사용 하 여 세 렌, 저쪽에 하 여 병 변의 힘을 활용 하는 신경 수 있다 그리고 수많은 뇌 영역의 기능을 통해 구조-기능 관계의 체계적인 연구를 통해 해명 되었습니다 했습니다. 병 변3,4.
그러나 올바르게 구조에 함수를 할당,, 병 변 연구는 부족 했던 지역 이다 정확한 정량화 절차 필요 합니다. 장애를 측정을 위한 현재 골드 표준 섹션, 마운트, 및 가벼운 현미경 이미지 두뇌입니다. 이미지 분할 영역 다음 아틀라스에 가장 가까운 부분에 일치와 과목에 걸쳐 변의 대략적인 좌표는 직접 보고, 종종 카메라 루시 다 이미지 또는 예제 조직학 조각3,4 사용 ,5,6,7,8,,910.
현재 병 변 부 량 절차의 부정확성을 넘어 이러한 기술은 시간과 실패 하는 경향이 있습니다. 뇌 경직, 블레이드 선명도, 및 온도에 작은 변화는 어설픈, 뒤틀린, 또는 찢어진 섹션으로 이어질 수 있습니다. 섹션 수 있습니다 또한 얼룩 하지 균등 하 게 하 고 설치 매체에 거품 때문에 몇 군데 잘못 될. 중요 한 것은, 단면, 시 뇌의 병 변의 위치의 3 차원 컨텍스트 손실, 두뇌 도전 병 변의 정확한 3D 개조를 만들기 됩니다.
병 변에 대 한 또 다른 일반적인 응용 단일 및 다중 전극 녹음 뇌에서의 위치 결정 되었습니다. 마지막 녹음 세션의 끝에, 연구팀은 전극 끝에 작은 전해질 병 변 유발 하 고 두뇌 조직학 기존 병 변 실험11에서 처리. 조직학 찾을 수 도전 되는 전해질 병 변 일반적으로 그들을 확인 하는 데 사용 하는 전극 보다 큰 하지만 충분히 작은 일반적으로 추가 문제, 위에서 설명한 동일한 단점에서 겪고 있다이 기술. Tetrode 배열의 경우 여러 전극 삽입 되 면 전해 병 변 통해 확인은 훨씬 더 도전. 대신 전해 병 변은 나중에12, 조직학 확인 전극에 염료를 사용 하 여 하지만이 기술은 전통적인 조직학와 함께 제공 되는 동일한 단점이 있습니다 겪고 있다.
여기, 우리는 깊이 있는 설명 얼룩 전자 현미경 (EM) 및 x-선 기법에 따라 최근 설명된 방법13 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 병 변 단정 하 고 전류 보다 작은 동물 두뇌에서 전극을 찾습니다 방법입니다. 마이크로-CT는 엑스레이 선과 하지 샘플에서 반사 하는 엑스레이 수집 하는 동안 360 ° 회전 하는 샘플에서 촬영 하는 이미징 기법입니다. 결과 어떤 방향으로 시각화 하 고 정확 하 게 측정할 수 있는 샘플의 고해상도 디지털 3D 재구성. 많은 교육 기관 있다 마이크로 CT 스캐너, 상업적으로 사용할 수 있습니다.
다음은 프로토콜에 중요 한 단계: 첫째, PFA와 조지아 동물 perfuse 이후 두뇌를 수정 후의 조합의 사용 했다 조직의 일관 된 전체 오스뮴 침투를 달성 하는 최고. 우리가 테스트 하지 않 았 명시적으로, 비록 그럴듯한 설명이입니다 PFA 고정 가역15, 반면 조지아 고정은 가역16,17. 오스뮴 tetroxide에서 2 주간 배양 조직의 전체 침투에 대 한 필?…
The authors have nothing to disclose.
저자 감사 합니다 그렉 린과 아서 McClelland 자신의 전문성에 대 한 마이크로-CT 기계와 데이비드 리치몬드 및 이미지에서 헌터 엘리엇과 데이터 분석 코어 (IDAC) 처리 조언, 그들의 이미지에 대 한 하버드의과 대학에 보스턴에서 윌리엄 Liberti 기꺼이 얼룩말 피리 새 류 두뇌를 제공 하는 대학. 이 작업 수행 되었다 일부 센터에서 대 한 나노 시스템 (CNS), 구성원의는 국가 나노기술 조정 인프라 네트워크 (NNCI), NSF 보너스 번호 1541959에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는. CNS는 하버드 대학교의 일부입니다. 이 작품은 리처드와 수잔 스미스 가족 재단과 IARPA (계약 #D16PC00002)에 의해 지원 되었다. S.B.E.W. 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP;에서 장학금에 의해 지원 되었다 LT000514/2014)와 유럽 분자 생물학 기구 (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. 여는 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 친교 프로그램 (GRFP)을 지원 했다.
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |