Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem
Summary
Bu makalede küçük hayvan beyin mikro-CT görüntüleme, hangi lezyonlar sayılabilir ve tüm beyin bağlamında yüksek hassasiyetle yer alan elektrotlar hazırlamak için basit bir yöntem.
Abstract
Lezyon ve elektrot konumu doğrulama geleneksel yolu ile histolojik inceleme lekeli Beyin dilimleri, el ile tahmini gerektirir zaman alıcı bir işlem yapılır. Burada, lezyonlar miktarının ve elektrotlar daha az zahmetli ve daha ayrıntılı sonuçlar verir beyin bulmak için basit, kolay bir yöntemi açıklanmaktadır. Bütün beyin osmiyum tetroxide ile lekeli, reçine gömülü ve mikro-CT tarayıcı ile görüntüsü. 3D dijital birimleri kararları ve sanal bölüm kalınlıkları örnek boyutu üzerinde bağımlı ile beyin taramaları sonucunda (voxel sıçan ve zebra finch için başına 12-15 ve 5-6 µm beyin, sırasıyla). Yüzey ve derin lezyonlar ile karakterize ve tek tetrodes, tetrot diziler, elektrolitik lezyonlar ve silikon sondalar de yerelleştirilmiş olabilir. Özgür ve özel mülk yazılım Denemecileri el ile veya otomatik olarak herhangi bir uçak ve segment birim numune hacmi incelemek izin verir. Bu yöntem tüm beyin hacmi oluşturduğu için lezyonlar ve elektrotlar karşılaştırmaları içinde ve çalışmalar arasında standart hale getirmek yardımcı olacaktır geçerli yöntemleri çok daha yüksek derecede sayısal.
Introduction
Nörologlar lezyonlar uzun süre üzerinde işlev ve beyin konumda arasındaki ilişkiyi anlamak için güveniyorlar. Örneğin, öğrenme ve hafıza için vazgeçilmez olarak hipokampus ve dürtü kontrol için anahtar olarak prefrontal korteks anladığımız kadarıyla her iki ürün insanlar1,2serendipitous lezyonların edildi. Ancak, hayvan modelleri kullanımını nörologlar lezyonlar serendipity ötesine giderek yararlanmak izin verdi ve sayısız beyin bölgeleri fonksiyonu yapı-fonksiyon ilişkilerin sistematik çalışmalar aracılığıyla aydınlatılmamıştır lezyonlar3,4.
Doğru işlevi için bir yapı atamak için ancak, eksik bir alandır kesin miktar yordamlar lezyon çalışmaları gerektirir. Bölüm, bağlama, bir ışık mikroskobu ile görüntü beyin lezyonlar miktarının geçerli altın standart etmektir. Görüntülü dilimleri sonra bir atlas en yakın bölümleri için eşleştirilir ve konular arasında lezyonların yaklaşık koordinatları dolaylı olarak, genelde kamera lucida görüntüleri veya örnek histolojik dilimler3,4 kullanılarak raporlanır ,5,6,7,8,9,10.
Tutarsızlık mevcut lezyon miktar yordamlar, bu teknikleri zaman alan ve hata eğilimli. Küçük değişiklikler beyin sertlik, bıçak netlik ve sıcaklık berbat, çarpık ya da bozuk bölümleri için yol açabilir. Bölümleri de düzensiz leke olabilir ve yanlış montaj orta kabarcıkları nedeniyle yansıması. Önemlisi, kesit üzerine, beyin konumda lezyon’ın üç boyutlu bağlamında, beyin zorlu lezyon kesin 3D yeniden yapım kaybolur.
Lezyonlar için başka bir ortak uygulama tek ve birden çok elektrot kayıtları beyindeki konumunu belirlemek için olmuştur. Son kayıt oturumu sonunda, araştırmacılar küçük elektrolitik lezyonlar elektrot uç teşvik ve beyin histolojik olarak bir geleneksel lezyon deneme11‘ olarak işlemek. Bu teknik elektrolitik lezyonlar genellikle onları yapmak için kullanılan elektrotlar büyüktür ama genellikle küçük varlık ki ek sorunları yukarıda açıklanan aynı dezavantajları bu histolojik olarak bulmak için meydan uğrar. Birden çok elektrotlar eklendiğinde tetrot dizi durumunda olduğu gibi doğrulama elektrolitik lezyon üzerinden bile daha zordur. Daha sonra histolojik olarak12doğrulamak için elektrot üzerine boya kullanımı elektrolitik lezyonlar için bir diğer seçenek olmakla bu tekniği ile geleneksel Histoloji gel aynı sakıncaları çekiyor.
Burada, biz ayrıntılı tarif elektron mikroskobu (EM) ve x-ışını teknikleri boyama dayalı bir son zamanlarda açıklanan yöntemi13 bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) lezyonlar quantifies ve akım daha iyi küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulur yöntemleri. Mikro-CT içinde bir scintillator tarafından örnek olamaz değil röntgen toplarken 360 ° döndürülmüş bir örnek x-ışınları ateş bir görüntüleme tekniğidir. Herhangi bir yönde görüntülenir ve tam sayısal örnek bir yüksek çözünürlüklü dijital 3D yeniden yapılanma sonucudur. Birçok akademik kurum are da elde edilebilir ticari olarak mikro-CT tarayıcıları var.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol için önemli adımlar şunlardır: ilk olarak, İngiltere’de yılın ve GA hayvan sıvı ve daha sonra beyin sonrası düzeltmek için bir arada kullanımı tutarlı tam osmiyum penetrasyon dokusunun ulaşmak için her şeyden. Her ne kadar biz bu açıkça did değil sınav, GA fiksasyon değil tersinir16,17ise makul bir açıklama PFA fiksasyon tersinir15, olmasıdır. Bir iki haftalık kuluçka osmiyum tetroxide içinde tam do…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Greg Lin ve Arthur McClelland kendi uzmanlık için mikro-CT makine, David Richmond ve Hunter Elliott, görüntü ve veri analizi çekirdek (IDAC), Harvard Tıp Okulu tavsiye işleme görüntü için ve William Liberti, Boston ile teşekkür ederiz Üniversite nezaketle zebra finch beyin sağlamak için. Bu eser için nano sistemleri (CNS), bir üye, Ulusal Nanoteknoloji koordine altyapı ağı (NSF Ödülü No 1541959 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen NNCI), kısmen merkezinde gerçekleştirildi. CNS Harvard Üniversitesi’nin bir parçasıdır. Bu eser Richard ve Susan Smith Aile Vakfı ve IARPA (sözleşme #D16PC00002) tarafından desteklenmiştir. S.B.E.W. insan sınır bilim programı (HFSP; dan arkadaş grupları tarafından desteklenmiştir LT000514/2014) ve Avrupa Moleküler Biyoloji organizasyon (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. Ulusal Bilim Vakfı (NSF) yüksek lisans araştırma bursu programı (GRFP tarafından) destek verdi.
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
