Un metodo basati su Micro-CT per la caratterizzazione di lesioni e posizionamento elettrodi nel cervello degli animali piccoli
Summary
Questo articolo viene descritto un metodo semplice per preparare piccoli cervelli animali per l’imaging di micro-CT, in quale le lesioni possono essere quantificate ed elettrodi che si trova con alta precisione nel contesto dell’intero cervello.
Abstract
Verifica posizione di lesione e l’elettrodo sono tradizionalmente fatto tramite esame istologico di fettine di cervello macchiato, una procedura che richiede tempo che richiede la valutazione manuale. Qui, descriviamo un metodo semplice e diretto per quantificare le lesioni e l’individuazione di elettrodi nel cervello che è meno faticoso e produce risultati più dettagliati. Cervello intero è macchiati con tetrossido di osmio, incorporata in resina e imaged con uno scanner di micro-CT. Le scansioni si tradurrà in volumi 3D digitale dei cervelli con risoluzioni e spessori virtuale dipende la dimensione del campione (12 – 15 e 5 – 6 µm a voxel per ratto e zebra finch cervelli, rispettivamente). Lesioni superficiali e profonde possono essere caratterizzate e singolo tetrodi, matrici tetrodo, lesioni elettrolitiche, e sonde di silicio possono anche essere localizzati. Software libero e proprietario permette sperimentatori esaminare il volume del campione da qualsiasi aereo e segmento il volume manualmente o automaticamente. Perché questo metodo genera volume intero cervello, lesioni e gli elettrodi possono essere quantificati a un grado molto più alto rispetto a metodi attuali, che vi aiuterà a standardizzare i confronti all’interno e attraverso gli studi.
Introduction
I neuroscienziati hanno contato sulle lesioni per lungo tempo al fine di comprendere la relazione tra funzione e posizione nel cervello. Per esempio, la nostra comprensione dell’ippocampo come essendo indispensabile per l’apprendimento e memoria e della corteccia prefrontale come chiave per il controllo degli impulsi era entrambi i prodotti di serendipitous lesioni in esseri umani1,2. L’utilizzo di modelli animali, tuttavia, ha permesso neuroscienziati sfruttare la potenza delle lesioni andando oltre serendipity, e la funzione delle innumerevoli zone del cervello è stata delucidata attraverso studi sistematici delle relazioni struttura-funzione attraverso lesioni3,4.
Per assegnare correttamente la funzione di una struttura, tuttavia, studi lesionali richiedono procedure di quantificazione precisa, che è una zona che è stata carente. Il gold standard attuale per quantificare le lesioni è a sezione, Monte e il cervello di immagine con un microscopio ottico. Le fette imaged sono poi abbinate alle sezioni più vicini su un Atlante e le coordinate approssimative delle lesioni attraverso gli oggetti vengono segnalate indirettamente, spesso attraverso l’uso di immagini macchina fotografica lucida o esempio fette istologico3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Di là dell’imprecisione delle attuali procedure di quantificazione di lesione, queste tecniche sono che richiede tempo e incline al fallimento. Piccoli cambiamenti nel cervello rigidità, acutezza della lamierina e temperatura può portare a sezioni raffazzonate, deformate o lacerate. Sezioni possono anche macchiare in modo non uniforme ed essere imaged in modo non corretto a causa di bolle nel liquido di montaggio. Importante, al momento di sezionamento, contesto tridimensionale della posizione della lesione nel cervello è perduto, facendo puntuale ricostruzione 3D della lesione nel cervello impegnativo.
Un’altra applicazione comune per le lesioni è stato quello di determinare la posizione del singolo e le registrazioni multiple di elettrodi nel cervello. Alla fine della sessione di registrazione finale, ricercatori inducono piccole lesioni elettrolitiche presso la punta dell’elettrodo ed elaborano il cervello istologicamente come fatto in un esperimento di lesione convenzionali11. Questa tecnica soffre le stesse controindicazioni descritte sopra, con ulteriori problemi è che le lesioni elettrolitiche sono solitamente più grandi degli elettrodi utilizzati per la loro ma sono solitamente abbastanza piccole che essi sono difficili da trovare istologicamente. Quando vengono inseriti elettrodi multipli, come nel caso di una matrice di tetrodo, verifica attraverso lesioni elettrolitiche è ancora più difficile. Un’alternativa alle lesioni elettrolitiche è l’uso di un colorante sull’elettrodo per poi verificare istologicamente12, ma questa tecnica soffre le stesse controindicazioni che vengono con istologia convenzionale.
Qui, descriviamo approfondita un metodo recentemente descritto13 basato su tecniche a raggi x e microscopia elettronica (EM) di colorazione la tomografia computata (micro-CT che quantifica le lesioni e individua gli elettrodi nel cervello degli animali piccoli meglio di corrente) metodi. Micro-CT è una tecnica di imaging in cui i raggi x sono sparato un campione che viene ruotato di 360° mentre uno scintillatore raccoglie i raggi x non ha deviato dal campione. Il risultato è una ricostruzione 3D digitale ad alta risoluzione del campione che possa essere visualizzato in qualsiasi orientamento e quantificato con precisione. Molte istituzioni accademiche hanno micro-CT scanner, che sono anche disponibili in commercio.
Protocol
Representative Results
Discussion
I seguenti sono passaggi critici del protocollo: in primo luogo, l’uso di una combinazione di PFA e GA per irrorare l’animale e successivamente post-fissare il cervello è stato fondamentale per il raggiungimento di penetrazione coerente osmio completo del tessuto. Anche se non abbiamo provato questo in modo esplicito, una spiegazione plausibile è che la fissazione di PFA è reversibile15, considerando che la fissazione di GA non è reversibile16,<sup class="xre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Greg Lin e Arthur McClelland per la loro esperienza con la macchina di micro-CT, David Richmond e Hunter Elliott l’immagine e dati analisi Core (IDAC) presso la Harvard Medical School per loro consigli di elaborazione di immagini e William Liberti a Boston Università per fornire gentilmente un cervello zebra finch. Quest’opera è stata eseguita in parte al centro per sistemi su scala nanometrica (CNS), un membro della nazionale nanotecnologia coordinato infrastruttura rete (NNCI), che è sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio NSF n. 1541959. CNS è una parte dell’Università di Harvard. Questo lavoro è stato supportato dal Richard e Susan Smith Family Foundation e IARPA (contratto #D16PC00002). S.B.E.W. è stato sostenuto da borse di studio dalla Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) e l’organizzazione europea di biologia molecolare (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship programma (GRFP).
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
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