Un método basado en el Micro-CT para caracterizar las lesiones y la localización de electrodos en cerebros de animales pequeños
Summary
Este artículo describe un método sencillo para preparar pequeños cerebros animales micro-CT en la proyección de imagen, en que las lesiones se pueden cuantificar y electrodos con alta precisión en el contexto de todo el cerebro.
Abstract
Verificación de localización de lesión y electrodo tradicionalmente se realizan a través de la examinación histológica de rebanadas de cerebro manchada, un procedimiento desperdiciador de tiempo que requiere la estimación manual. Aquí, describimos un método simple y directo para cuantificar las lesiones y localización de los electrodos en el cerebro que es menos laborioso y produce resultados más detallados. Cerebro entero es teñida con tetróxido de osmio, incrustado en resina y fotografiada con un explorador micro-CT. Las exploraciones como resultado volúmenes digitales 3D de los cerebros con resoluciones y espesores de la sección virtual depende del tamaño de muestra (12 – 15 y 5 – 6 μm por voxel para rata y Pinzón de la cebra de cerebros, respectivamente). Lesiones superficiales y profundas pueden ser caracterizadas y solo tetrodos, arreglos de discos de tetrodo, lesiones electrolíticas, y sondas de silicio también pueden ser localizadas. Software libre y propietario permite experimentadores examinar el volumen de la muestra desde cualquier plano y el volumen del segmento manualmente o automáticamente. Debido a que este método genera volumen de todo el cerebro, lesiones y electrodos pueden cuantificarse en un grado mucho más alto que en los métodos actuales, que le ayudará a estandarizar las comparaciones dentro y a través de estudios.
Introduction
Neurocientíficos han dependido de las lesiones durante mucho tiempo para entender la relación entre la función y ubicación en el cerebro. Por ejemplo, nuestra comprensión del hipocampo como indispensable para el aprendizaje y la memoria y de la corteza prefrontal como clave para el control de los impulsos era ambos productos de serendipidad lesiones en los seres humanos1,2. El uso de modelos animales, sin embargo, ha permitido neurocientíficos aprovechar el poder de las lesiones por ir más allá de serendipity, y la función de numerosas áreas del cerebro ha sido dilucidada a través de estudios sistemáticos de las relaciones estructura y función a través de las lesiones de3,4.
Para asignar correctamente la función a una estructura, sin embargo, estudios de lesión requieren procedimientos de cuantificación precisa, que es un área que ha sido. El estándar de oro actual para la cuantificación de las lesiones es a sección, montaje y cerebros de imagen con un microscopio de luz. Las rebanadas de la imagen luego se corresponden a las secciones más cercanas en un atlas, y las coordenadas aproximadas de las lesiones a través de temas se comunican indirectamente, a menudo mediante el uso de imágenes de cámara lúcida o ejemplo cortes histológicos3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Más allá de la imprecisión de los procedimientos de cuantificación de lesión actual, estas técnicas son lentos y propensos al fracaso. Pequeños cambios en la rigidez cerebral, filo de cuchilla y temperatura puede conducir a secciones botched, deformadas o rotas. Secciones pueden también manchar irregularmente y mal ser reflejadas debido a las burbujas en el medio de montaje. Lo importante, al seccionamiento, el contexto tridimensional de la localización de la lesión en el cerebro se pierde, que precisa reconstrucción 3D de la lesión en el cerebro un reto.
Otra aplicación común para las lesiones ha sido determinar la ubicación de simple y múltiples grabaciones de electrodo en el cerebro. Al final de la sesión de grabación final, los investigadores inducen pequeñas lesiones electrolíticas en la punta del electrodo y procesan el cerebro histológico como hecho en un experimento convencional lesión del11. Esta técnica adolece de los mismo inconvenientes descritos anteriormente, con problemas adicionales ya que las lesiones electrolíticas son generalmente más grandes que los electrodos utilizados para hacerlos pero son generalmente bastante pequeñas que son difíciles de encontrar histológico. Cuando se insertan electrodos múltiples, como en el caso de una matriz de tetrodo, la verificación a través de lesiones electrolíticas es incluso más difícil. Una alternativa a las lesiones electrolíticas es el uso de un colorante en el electrodo para más tarde comprobar histológicamente12, pero esta técnica adolece de los mismos inconvenientes que vienen con la histología convencional.
Aquí, describimos a fondo un método recientemente descrito13 basado en técnicas de microscopía electrónica (EM) y rayos x de tinción la tomografía computada (micro-CT que cuantifica las lesiones y localiza más corriente de electrodos en cerebros de animales pequeños) métodos. Micro-CT es una técnica de imagen en la que se disparan rayos x en una muestra que gira 360° mientras un scintillator recoge los rayos x no se desvió por la muestra. El resultado es una reconstrucción 3D digital alta resolución de la muestra que puede ser visualizada en cualquier orientación y cuantificar precisamente. Muchas instituciones académicas tienen micro-CT escáneres, que están disponibles comercialmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los siguientes son pasos críticos en el protocolo: en primer lugar, el uso de una combinación de PFA y GA a inundar el animal y posteriormente fijar después el cerebro fue fundamental para lograr la penetración constante de osmio completo del tejido. Aunque nos no probar esto explícitamente, una explicación plausible es que la fijación del PFA es reversible15, mientras que GA fijación no es reversible16,17. Porque una incubación d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen Greg Lin y Arthur McClelland su experiencia con la máquina micro-CT, David Richmond y Hunter Elliott en la imagen y base de análisis de datos (IDAC) en Harvard Medical School para su Consejo de procesamiento de imágenes y William Liberti en Boston Universidad para proporcionar amablemente un cerebro del pinzón de la cebra. Este trabajo fue realizado en parte en el centro de sistemas de nanoescala (CNS), un miembro de la nacional nanotecnología coordinada infraestructura red (NNCI), que es apoyado por la National Science Foundation bajo premio NSF no. 1541959. CNS es una parte de la Universidad de Harvard. Este trabajo fue apoyado por el Richard y Susan Smith Family Foundation y IARPA (contrato #D16PC00002). S.B.E.W. fue apoyado por becas del programa de ciencia frontera humana (HFSP; LT000514/2014) y la Organización Europea de Biología Molecular (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. fue apoyado por la National Science Foundation (NSF) postgrado investigación beca programa (GRFP).
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
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