שיטה המבוססות על מיקרו-CT אפיון נגעים ואיתור אלקטרודות במוח בעלי חיים קטנים
Summary
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה כדי להתכונן מוח בעל חיים קטן מיקרו-CT הדמיה, פצעים אשר ניתן לכמת, אלקטרודות הממוקם עם דיוק גבוהה בהקשר של המוח כולו.
Abstract
אימות מיקום הנגע, אלקטרודה נעשים באופן מסורתי באמצעות היסטולוגית בחינת פרוסות המוח מוכתם, הליך גוזלת זמן זה דורש הערכה ידנית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוט, פשוט לכימות נגעים ואיתור אלקטרודות במוח פחות מייגעת, מניבה תוצאות מפורטות יותר. כל המוח הן מוכתמות אוסמיום ארבע-חמצני, המוטבעות שרף, עם תמונה עם סורק מיקרו-CT. הסריקות לגרום בכמויות דיגיטלית תלת-ממד של המוח עם רזולוציות, סעיף וירטואלי עוביים תלויים גודל המדגם (מיקרומטר 12-15 ו- 5 – 6 לכל voxel עכברוש, זברה פינק המוח, בהתאמה). נגעים משטח עמוק ניתן לאפיין, יחיד tetrodes, tetrode מערכים, נגעים electrolytic ואני גם יכול להיות מקומי סיליקון הגששים. תוכנה חופשית, הקניינית מאפשרת ניסויים לבחון האחסון מדגם של כל מטוס, קטע עוצמת הקול באופן ידני או אוטומטי. כי שיטה זו יוצרת נפח כל המוח, נגעים ואלקטרודות ניתן לכמת את רמה גבוהה יותר מאשר בשיטות הנוכחי, אשר יסייע לתקנן השוואות בתוך ועל -פני לימודי.
Introduction
מדעני מוח צריכים לסמוך על נגעים במשך זמן רב כדי להבין את הקשר בין פונקציית המיקום במוח. לדוגמה, ההבנה שלנו של ההיפוקמפוס כמו להיות הכרחית למידה וזיכרון ואת קליפת המוח הקדם חזיתית בתור מפתח עבור שליטה בדחפים היו שני המוצרים של נגעים החרס בני אדם1,2. השימוש במודלים, עם זאת, אפשרה מדעני מוח כדי לרתום את העוצמה של נגעים על ידי מעבר סרנדיפיות, הפונקציה של אזורים במוח אינספור יש כבר הובהר באמצעות מחקרים שיטתיים של מבנה פונקציה קשרים באמצעות נגעים3,4.
להקצאת כראוי של הפונקציה למבנה, אולם, הנגע מחקרים דורשות כימות מדויק נהלים, אשר הוא אזור יש שהיה חסר. תקן הזהב הנוכחי עבור לכימות נגעים היא סעיף, הר, והמוח תמונה עם מיקרוסקופ אור. הפרוסות שבעורך ואז מתאימים לסעיפים הקרוב ב אטלס, נקודות הציון המשוער של נגעים על פני נושאים באופן עקיף מדווחים, לעיתים קרובות באמצעות מצלמה lucida תמונות או דוגמה היסטולוגית פרוסות3,4 ,5,6,7,8,9,10.
מעבר העוסקת מההליכים כימות הנגע הנוכחי, טכניקות אלה הן זמן רב מועדת לכישלון. שינויים קטנים בתוך המוח נוקשות, חדות הלהב וטמפרטורה יכול להוביל מקטעים הכושלת, מעוותת או קרועה. מקטעים באפשרותך גם כתם לצר, לדימות כראוי בגלל בועות המדיום הרכבה. חשוב, על חלוקתה, ההקשר תלת מימדי של המיקום של הנגע במוח הוא הפסיד, ביצוע שחזור תלת-ממד מדויקות של הנגע מאתגרת המוח.
יישום נפוץ אחר לחבלות היה לקבוע את המיקום של יחיד, הקלטות מרובות אלקטרודה במוח. בסוף להקלטות הסופי, חוקרים זירוז נגעים electrolytic קטן בקצה האלקטרודה ולעבד המוח בהיסטולוגיה כפי שנעשה ניסוי11של הנגע קונבנציונלי. טכניקה זו סובל החסרונות באותו שתוארה לעיל, עם בעיות נוספות בכך נגעים electrolytic בדרך כלל גדולים יותר האלקטרודות נהגה להכין אותם. אבל הם בדרך כלל קטנים מספיק כי הם הם מאתגרים למצוא בהיסטולוגיה. כאשר מספר אלקטרודות מוכנסים, כמו במקרה של מערך tetrode, אימות דרך נגעים electrolytic הוא יותר מאתגר. אלטרנטיבה נגעים electrolytic הוא השימוש של צבע על האלקטרודה כדי מאוחר יותר לאמת בהיסטולוגיה12, אך טכניקה זו סובלת החסרונות אותו עם היסטולוגיה קונבנציונלי.
כאן, אנו מתארים מעמיק שיטת תיאר לאחרונה13 בהתבסס על צביעת טכניקות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ו רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (מיקרו-CT) מכמתת נגעים, מאתרת אלקטרודות במוח בעל חיים קטן יותר הנוכחי שיטות. מיקרו-CT היא טכניקת הדמיה שבו צילומי רנטגן הם ירו מדגם מסובבת 360° בזמן scintillator אוספת את צילומי הרנטגן לא מוסח על ידי המדגם. התוצאה היא שחזור תלת-ממד דיגיטלית ברזולוציה גבוהה של המדגם שניתן דמיינו בכיוון כלשהו או לכמת במדויק. מוסדות אקדמיים רבים יש מיקרו-CT סורקים, אשר הינם גם זמינים מסחרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
להלן השלבים הקריטיים לפרוטוקול: ראשית, השימוש בשילוב של כדורגלן GA perfuse החיה, לאחר מכן שלאחר ולתקן את המוח היה בעל חשיבות עליונה כדי להשיג חדירה עקבית אוסמיום מלא של הרקמה. למרות שאנחנו? לא לבדוק את זה במפורש, הסבר מתקבל על הדעת הוא כדורגלן קיבעון הוא הפיך15, ואילו קיבוע GA אינו הפי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה גרג לין, ארתור מק’קללנד על המומחיות שלהם עם מכונת מיקרו-CT, דיויד ריצ’מונד, צייד אליוט על התמונה ו- Core ניתוח נתונים (IDAC) בבית הספר לרפואה בהרווארד לעיבוד עצה תמונה שלהם, ויליאם ליברטי בבוסטון אוניברסיטת למתן באדיבות מוח זברה פינק. העבודה בוצעה באופן חלקי במרכז עבור ננו מערכות (CNS), חבר של נבחרת ננוטכנולוגיה מתואמת תשתית רשת (NNCI), אשר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת ה-NSF פרס 1541959 מס. מערכת העצבים המרכזית היא חלק של אוניברסיטת הרווארד. עבודה זו נתמכה על ידי ריצ’ארד, קרן משפחת סמית סוזן IARPA (חוזה #D16PC00002). S.B.E.W. נתמך על ידי מלגות מתוך התוכנית המדע הגבול האנושי (HFSP; LT000514/2014), בארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית (EMBO; ALTF1561-2013). מטרות נעלות נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית (NSF) לתואר שני מחקר מלגת התוכנית (GRFP).
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
Referências
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
