التثبيت أفراد يعيش ايليجانس كاينورهابديتيس باستخدام رقاقة موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان أولتراثين إلكترونية مع "الاحتفاظ بالماء"
Summary
تم إنشاء سلسلة من أساليب التثبيت للسماح تشعيع المستهدفة ليعيش ايليجانس كاينورهابديتيس الأفراد استخدام موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان رقيقة جداً وضعت مؤخرا رقاقة مع الاحتفاظ بالماء. هذا التثبيت على شريحة الرواية أيضا مناسبة للتصوير الملاحظات. يرد شرح معالجة مفصلة وأمثلة التطبيق للرقاقة.
Abstract
الإشعاع يستخدم على نطاق واسع للتطبيقات البيولوجية وتربية أيون-شعاع، ومن بين هذه الأساليب، تشعيع ميكروبيم يمثل وسيلة قوية لتحديد مواقع راديوسينسيتيفي في الكائنات الحية. وتصف هذه الورقة مجموعة من أساليب التثبيت على الرقاقة المتقدمة تشعيع ميكروبيم المستهدفة من الأفراد يعيشون من ايليجانس كاينورهابديتيس. جدير بالذكر أن معاملة رقائق موائع جزيئية بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) أننا سبق أن وضعت لشل C. ايليجانس الأفراد دون الحاجة للتخدير وهو شرح بالتفصيل. هذه الرقاقة، المشار إليها كورقة دودة، مرونة للسماح للقنوات موائع جزيئية لتوسيع نطاق، والمرونة يسمح الحيوانات أن يلفها بلطف. أيضا، نظراً لقدرة الامتزاز الذاتي PDMS، يمكن مختومة الحيوانات في القنوات التي تغطي سطح الورقة الدودة مع فيلم غطاء رقيقة، وفيها الحيوانات هي لا دفعت إلى القنوات للعلبة. بتحول الغلاف الفيلم أكثر، يمكننا بسهولة جمع الحيوانات. وعلاوة على ذلك، ورقة الدودة يظهر الاحتفاظ بالماء ويسمح للأفراد C. ايليجانس يخضعون للمراقبة المجهرية لفترات طويلة في ظروف العيش. وباﻹضافة إلى ذلك، الورقة هو فقط 300 ميكرون سميكة، مما يسمح لأيونات ثقيلة مثل أيونات الكربون لتمرير من خلال الورقة مرفقا بها الحيوانات، مما يسمح للجزيئات أيون أن يتم الكشف عن والجرعة الإشعاعية التطبيقية التي تقاس بدقة. لأن اختيار الأفلام غطاء يستخدم لإحاطة الحيوانات مهم جداً لنجاح التثبيت طويلة الأجل، نحن إجراء اختيار الأفلام تغطية مناسبة وأظهر أحد الموصى به بين بعض الأفلام. كمثال على تطبيق الرقاقة، قدمنا التصوير مراقبة أنشطة العضلات للحيوانات التي أرفق بها القناة موائع جزيئية الورقة دودة، فضلا عن تشعيع ميكروبيام. هذه الأمثلة تبين أن الأوراق دودة توسعت إلى حد كبير إمكانيات إجراء تجارب بيولوجية.
Introduction
الإشعاع، بما في ذلك الأشعة السينية وأشعة غاما وأشعة أيونات ثقيلة، يستخدم على نطاق واسع للتطبيقات البيولوجية كما هو الحال في تشخيص مرض السرطان وعلاجه، وتربية أيون-شعاع. وتركز على آثار الإشعاع1،،من23حاليا العديد من الدراسات والتطورات التقنية. تشعيع ميكروبيام وسيلة قوية لتحديد مواقع راديوسينسيتيفي في معيشة الكائنات الحية4. تاكاساكي متقدمة الإشعاع بحوث المعهد من “المعاهد الوطنية” الكم و “العلوم الإشعاعية” والتكنولوجيا (QST-تاكاساكي) وقد تم تطوير تكنولوجيا تشعيع الخلايا الفردية تحت الملاحظة المجهرية باستخدام أيونات ثقيلة microbeams5، وأنشأت طرق لتمكين تشعيع ميكروبيام مستهدفة من العديد من الحيوانات النموذجية، مثل ديدان أسطوانية4، ايليجانس كاينورهابديتيس6،7من دود القز و Oryzias latipes (الميداكا اليابانية)8. تشعيع ميكروبيام المستهدفة من السلكية C. ايليجانس يسمح ضربة قاضية فعالة لمناطق محددة، مثل الحلقة العصبية في منطقة الرأس، مما يساعد على تحديد دور كل من هذه الأنظمة في عمليات مثل الحركة.
وقد وضعت طريقة للتثبيت على شريحة من الأفراد C. ايليجانس دون الحاجة للتخدير للسماح ل تشعيع ميكروبيام4. وبالإضافة إلى ذلك، تحسين موائع جزيئية الرقائق المستخدمة في الدراسة السابقة4، مؤخرا وضعنا رقائق موائع جزيئية قابل للبلل، وأيون-حدودية، بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، المشار إليها كدودة أوراق (انظر الجدول للمواد)، شل حركة الأفراد ايليجانس جيم- 9. تشمل هذه الأوراق الناعمة رقيقة جداً (سمك = 300 ميكرون؛ العرض = 15 مم؛ طول = 15 ملم) مع عدة قنوات موائع جزيئية مستقيمة (20 أو 25) (عمق = 70 ميكرومتر؛ العرض = 60 ميكرومتر أو 50 ميكرومتر؛ طول = 8 مم) على السطح (الشكل 1-د). قنوات موائع جزيئية مفتوحة والسماح للحيوانات متعددة إحاطتها لهم في نفس الوقت (الشكل 1ﻫ). الأوراق مرنة للسماح للقنوات موائع جزيئية لتوسيع (بواسطة ~ 10%، الرقم 1و)، وتسمح المرونة الحيوانات أن يلفها بلطف. أيضا، نظراً لقدرة الامتزاز الذاتي PDMS، يمكن مختومة الحيوانات في القنوات التي تغطي سطح الورقة الدودة مع فيلم غطاء رقيقة، وفيها الحيوانات هي لا دفعت إلى القنوات للعلبة. بتحول الغلاف الفيلم أكثر، يمكننا بسهولة جمع الحيوانات.
القنوات التي لا تؤذي الديدان عندما يجري المحاطة أو عند جمعها. وعلاوة على ذلك، الأوراق مصنوعة من PDMS، الذي أساسا مسعور، ولكن الاحتفاظ بالماء يمكن أن يتحقق بأساليب هيدروفيليسيتي للمواد. الاحتفاظ بالماء، وسمك خصائص مواتية للأوراق دودة. قدرة الاحتفاظ بالماء يمنع جفاف الحيوانات بعد التثبيت طويلة وتمكن الملاحظات الطويلة الأجل الاضطلاع.
وباﻹضافة إلى ذلك، كما هو موضح سابقا9، الأوراق هي فقط 300 ميكرون سميكة، مما يتيح الأيونات الثقيلة مثل أيونات الكربون (مع مجموعة من حوالي 1 ملم في المياه) بالمرور من خلال الورقة مرفقا بها الحيوانات. هذا يسمح للجزيئات أيون للكشف عنها والجرعة الإشعاعية التطبيقية التي تقاس بدقة. وعلاوة على ذلك، الأوراق الدودة يمكن إعادة استخدامها، ومن ثم اقتصادية. مع أسلوب الحقن التقليدية، الحيوانات محاطة بالميت في بعض الأحيان وأنها لا يمكن أن تؤخذ من القناة؛ ويمكن أيضا أن تسد بيضها القنوات. وهذا يجعل من شرائح غير قابل للاستخدام. رقائق وبالتالي تكون أساسا القابل للتصرف، والتكاليف والفوائد نسبة الفقراء.
في هذه الورقة، ونحن تصف بالتفصيل مجموعة من الأساليب للتثبيت على شريحة من العيش C. ايليجانس الأفراد استخدام أوراق دودة. من خلال فحوصات تنقل الحيوانات ح 3 بعد التثبيت على شريحة، يمكننا تقييم الفيلم تغطية مناسبة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أظهرت الأمثلة على التثبيت على شريحة للملاحظات التصوير والإشعاع ميكروبيم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكين التثبيت على شريحة من C. ايليجانس تحت ظروف العيش باستخدام رقاقة موائع جزيئية PDMS قابل للبلل تشعيع ميكروبيم الكفاءة المستهدفة للحيوانات متعددة. سهولة المناولة والميزات لمنع تجفيف جعل هذا النظام مناسب للتطبيقات في تشعيع ميكروبيم، بل أيضا في العديد من الاختبارات السلوكية. هذه الأو?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور أتسوشي هيجاشيتاني لنوع المشورة فيما يتعلق بمعاملة C. ايليجانس والدكتور يويا هاتوري ويوكوتا يويشيرو كوباياشي ياشوهيكو للمناقشات القيمة. يشكر المؤلفون كاينورهابديتيس الوراثية مركز توفير سلالات ايليجانس جيم و هاء القولونية. ونحن نشكر طاقم سيكلوترون تيارا في تاكاساكي QST على مساعدتهم الطيبة مع تجارب التشعيع. ونحن نشكر الدكتور سوزان فورنس لتحرير مسودة لهذه المخطوطة. هذه الدراسة وأيده في جزء كاكينهي (منحة الأرقام JP15K11921 و JP18K18839) من JSPS لماجستير
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
- Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
- Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
- Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
- Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
- Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
- Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
- Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
- Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
- Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, 1757-1764 (2001).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genética. 206 (4), 1985-1994 (2017).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
- Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
- Lumirror Catalog. TORAY Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018)
- Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
- Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).
