קיבעון של אנשים חיים Caenorhabditis elegans באמצעות שבב Microfluidic של דקים ועומדים בטמפרטורות Polydimethylsiloxane עם החזקת מים
Summary
סדרה של שיטות הנייח הוקם כדי לאפשר את ההקרנות יישוב של חיה Caenorhabditis elegans יחידים באמצעות microfluidic polydimethylsiloxane דקים שפותחו לאחרונה על שבב עם החזקת מים. קיבעון על שבב הרומן הזה מספיקה גם הדמיה תצפיות. טיפול מפורט ודוגמאות ליישום של השבב מוסברים.
Abstract
קרינה נעשה שימוש נרחב עבור יישומים ביולוגיים, לגידול יונים-קרן אור, בין שיטות אלו, microbeam הקרנה ומייצג אמצעי רב עוצמה לזיהוי אתרים רגיש היצורים החיים. מאמר זה מתאר סדרה של קיבעון על שבב שיטות שפותחו עבור ההקרנות microbeam יישוב של אנשים לחיות על פי Caenorhabditis elegans. ראוי לציין, הטיפול של polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic שביבי שפיתחנו קודם לכן על מנת לשתק C. elegans יחידים ללא הצורך עבור הרדמה הסבר מפורט. השבב הזה, המכונה סדין תולעת, הוא גמיש כדי לאפשר את ערוצי microfluidic שיש להרחיב, ומאפשר את האלסטיות בעלי חיים כדי להיות אפוף בעדינות. כמו כן, בשל יכולת ספיחה עצמית של PDMS, חיות לפרטיים הערוצים על ידי כיסוי השטח של הגיליון תולעת עם סרט כיסוי דק, שבו חיות הם לא דחפו לתוך הערוצים עבור מארז. לפנות הכיסוי לצלם מעל, אנו יכולים בקלות לאסוף את החיות. יתר על כן, הגיליון תולעת מראה החזקת מים, מאפשר ליחידים C. elegans יהיה נתון תצפית מיקרוסקופית במשך פרקי זמן ארוכים בתנאים בשידור חי. בנוסף, הגיליון הוא רק עבה, ומאפשר יונים כבדים כגון פחמן יונים לעבור הגיליון תוחמת את החיות, ובכך מאפשר את החלקיקים יון יזוהו והמנה קרינה שימושית כדי למדוד במדויק 300 מיקרומטר. כי מבחר הסרטים מכסה המשמש תוחמת את בעלי החיים חשובה מאד מוצלח הנייח לטווח ארוך, אנו ניצח את מבחר הסרטים כיסוי מתאים, הראה אחד מומלץ בין כמה צילומים. כדוגמה היישום של השבב, הצגנו תצפית הדמיה של פעילויות שרירים של חיות תוחמת את הערוץ microfluidic של הגיליון תולעת, כמו גם את ההקרנות microbeam. דוגמאות אלה מצביעות על הסדינים תולעת הרחיבו מאוד את האפשרויות עבור ניסויים ביולוגיים.
Introduction
קרינה, כולל צילומי רנטגן, קרני גמא קרן כבד-יון, נעשה שימוש נרחב עבור יישומים ביולוגיים כגון אבחון סרטן וטיפול, לגידול יונים-קרן. אינספור מחקרים ופיתוחים טכני מתמקדים כעת ההשפעות של קרינה1,2,3. Microbeam הקרנה הוא אמצעי רב עוצמה לזיהוי אתרים רגיש חי אורגניזמים4. טקסאקי מתקדמת קרינה מחקר מכון של המכונים הלאומיים קוונטית, רדיולוגית למדע וטכנולוגיה (QST-טקסאקי) פיתח טכנולוגיה כדי לעורר תאים בודדים בהסתכלות מיקרוסקופית שימוש כבד-יון microbeams5, והוא ביסס את שיטות להפעלת microbeam יישוב הקרנה של בעלי חיים מספר דגם, כגון תולעים נימיות Caenorhabditis elegans4,6, תולעי המשי7, ו Oryzias latipes (ביפנית medaka)8. Microbeam יישוב הקרנה של נמטודות C. elegans מאפשר את נוקאאוט אפקטיבי של אזורים ספציפיים, כגון הטבעת עצבי באזור הראש, ובכך מסייעת לזהות את התפקידים של מערכות אלה תהליכים כגון גפיים.
פותחה שיטה הנייח על שבב של C. elegans יחידים ללא הצורך בהרדמה כדי לאפשר הקרנה microbeam4. בנוסף, כדי לשפר את שבבי microfluidic המשמשים את המחקר הקודם4, לאחרונה פיתחנו צ’יפס microfluidic polydimethylsiloxane wettable, יון-נחדרת, (PDMS), המכונה התולעת גיליונות (ראה טבלה של חומרים), עבור שיתק C. elegans יחידים9. אלה מהווים של סדינים רכים דקים (עובי = מיקרומטר 300; רוחב = 15 מ מ; אורך = 15 מ מ) עם מספר ערוצים microfluidic ישר (20 או 25) (עומק = מיקרומטר 70; רוחב = מיקרומטר 60 או 50 מיקרומטר; אורך = 8 מ מ) על פני השטח (איור 1י-ם). Microfluidic הערוצים פתוחים ומאפשרים מרובים בעלי חיים כדי להיות מוקף בהם בו זמנית (איור 1E). הסדינים גמישים כדי לאפשר את ערוצי microfluidic שיש להרחיב (על-ידי ~ 10%, איור 1F), ומאפשרת את האלסטיות בעלי חיים כדי להיות אפוף בעדינות. כמו כן, בשל יכולת ספיחה עצמית של PDMS, חיות לפרטיים הערוצים על ידי כיסוי השטח של הגיליון תולעת עם סרט כיסוי דק, שבו חיות הם לא דחפו לתוך הערוצים עבור מארז. לפנות הכיסוי לצלם מעל, אנו יכולים בקלות לאסוף את החיות.
הערוצים אל תפגע התולעים הם להיות מוקפים או כאשר הם נאספו. יתר על כן, המצעים עשויים PDMS, שהוא בעצם הידרופוביות, אבל החזקת מים יכולה להיות מושגת על ידי להקניית hydrophilicity לחומר. השמירה על המים ועל עובי הם מאפיינים חיוביים של הסדינים תולעת. קיבולת המים שימור מונע התייבשות של בעלי החיים לאחר הנייח ממושך ומאפשר תצפיות ארוכות טווח יבוצע.
בנוסף, כפי שתואר לעיל9, המצעים הם רק עבה, ומאפשר יונים כבדים כגון פחמן יונים (עם מגוון של-1 מ מ במים) לעבור הגיליון תוחמת את החיות 300 מיקרומטר. פעולה זו מאפשרת את החלקיקים יון יזוהו והמנה קרינה שימושית כדי למדוד במדויק. יתר על כן, הסדינים תולעת הניתנים לשימוש חוזר, ולפיכך הם חסכוני. בשיטת הזרקת קונבנציונאלי, החיות למכתב לפעמים מתים, הם לא יכול להילקח התעלה; הביצים שלהם יכולים להיסתם גם הערוצים. זה הופך את השבב לא שמיש. צ’יפס, ולכן הם, בעצם חד פעמיים, העלות-תועלת יחס.
בתוך המאמר הנוכחי, נתאר בפירוט סדרה של שיטות הנייח על שבב של C. elegans חיה באמצעות התולעת גליונות יחידים. באמצעות מבחני ומכניקה של בעלי חיים 3 שעות לאחר הנייח על שבב, הערכנו את הסרט כיסוי מתאים. בנוסף, הראנו הדוגמאות של קיבעון על שבב תצפיות הדמיה וגם הקרנה microbeam.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיבעון על שבב של C. elegans בתנאים בשידור חי באמצעות שבב microfluidic PDMS wettable מאפשר את ההקרנות microbeam ממוקד ויעיל של חיות מרובים. הקלות של טיפול ותכונות כדי למנוע התייבשות להפוך מערכת זו מתאים ליישומי לא רק הקרנה microbeam, אלא גם במספר מבחני התנהגות. גליונות תולעת אלה כבר ממוסחר, ניתן להשיג בקלות. שבב?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה ד ר אטסשי Higashitani עצה חיובית לגבי הטיפול של C. elegans , ד”ר הוא נקרא יויה האטורי, Yuichiro יוקוטה Yasuhiko קוביאשי לדיונים יקרי ערך. המחברים תודה המרכז הגנטי Caenorhabditis למתן זנים של C. elegans , e. coli. אנו מודים לצוות של ציקלוטרון של הכתר-QST-טקסאקי על הנדיבה שלהם עם הניסויים הקרנה. אנו מודים ד ר סוזן אביב לעריכה טיוטה של כתב היד הזה. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי KAKENHI (גרנט מספרים JP15K11921 ו- JP18K18839) מ- JSPS לטרשת נפוצה
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Referências
- Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
- Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
- Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
- Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
- Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
- Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
- Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
- Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
- Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, 1757-1764 (2001).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genética. 206 (4), 1985-1994 (2017).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
- Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
- Lumirror Catalog. TORAY Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018)
- Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
- Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).
